Luz 3D eficiente

Nov 23, 2023

Biología de las comunicaciones volumen 6, número de artículo: 170 (2023) Citar este artículo

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La capacidad de obtener imágenes de muestras de tejido humano en 3D, con resolución celular y un gran campo de visión (FOV), puede mejorar las investigaciones fundamentales y clínicas. Aquí, demostramos la viabilidad de la obtención de imágenes con láminas de luz de cerebro humano fijado con formalina de ~ 5 cm3 de tamaño y muestras de cáncer de próstata incluidas en parafina fijadas con formalina (FFPE) de hasta ~ 7 cm3 de tamaño, procesadas con el protocolo FFPE-MASH. Presentamos un prototipo de microscopía de lámina de luz, el microscopio de iluminación de plano selectivo de doble vista de tejido aclarado (ct-dSPIM), capaz de realizar adquisiciones rápidas en 3D de alta resolución de tejido aclarado a escala de cm3. Utilizamos escaneos en mosaico para obtener vistas generales rápidas en 3D de muestras de tejido completo o vistas generales de mayor resolución de grandes regiones de interés con varias velocidades: (a) Mosaico 16 (resolución isotrópica de 16,4 µm, ~1,7 h/cm3), (b) Mosaico 4 (resolución isotrópica de 4,1 µm) resolución, ~ 5 h/cm3) y (c) Mosaico 0,5 (0,5 µm de resolución casi isotrópica, ~15,8 h/cm3). Podríamos visualizar capas corticales y neuronas alrededor del borde de las áreas V1 y V2 del cerebro humano, y podríamos demostrar una calidad de imagen adecuada para la clasificación de la puntuación de Gleason en muestras gruesas de cáncer de próstata. Mostramos que las imágenes ct-dSPIM son una técnica excelente para evaluar cuantitativamente muestras de tejido humano a gran escala preparadas por MASH en 3D, con un potencial clínico futuro considerable.

A pesar de las claras ventajas de las visualizaciones de microestructuras a gran escala, las muestras de tejido en la investigación fundamental y la patología clínica todavía se examinan principalmente con microscopios ópticos convencionales en secciones de tejido finas como el papel (que oscilan entre aproximadamente 5 y 100 µm), montadas en portaobjetos de vidrio. Esto destruye la estructura 3D del órgano y proporciona sólo información 2D limitada en un pequeño campo de visión (FoV). Por lo tanto, se necesitan avances significativos hacia nuevos enfoques de microscopía multiescala 3D de alta velocidad y gran volumen con suficiente resolución. Esto permitirá la detección de detalles cruciales y características generales en todas las muestras de tejido grandes (que varían desde mm hasta cm de tamaño).

La compleja estructura 3D del cerebro humano es inherentemente multiescala y consta de estructuras muy pequeñas que se extienden a lo largo de grandes distancias, incluso áreas cerebrales enteras1. La citoarquitectura cortical en capas, por ejemplo, se define por la densidad, el tamaño y la morfología celular a escala microscópica, pero sus capas se extienden sobre áreas corticales enteras y, por lo tanto, las capas se producen en escalas de centímetros. Para permitir la caracterización cuantitativa, como el recuento de células, en varias capas e incluso en áreas enteras del cerebro, es necesario realizar exploraciones generales del FoV de gran tamaño, así como imágenes celulares de alta resolución. Este tipo de datos es esencial, por ejemplo, para un modelado neuronal realista y biológicamente fundamentado2. Por lo tanto, la investigación de la citoarquitectura en capas requiere imágenes de alta resolución y FoV grandes.

En el cáncer de próstata, los tumores se caracterizan por una multifocalidad y una morfología heterogénea con diversos patrones histomorfológicos en 3D, a lo largo de volúmenes extendidos3,4. Hasta la fecha, un diagnóstico definitivo de cáncer de próstata requiere la verificación histopatológica de biopsias basadas en la clasificación del Gleason Score3. Esto supone un desafío, como lo demuestra la variabilidad entre observadores, que a su vez puede conducir a un tratamiento insuficiente o excesivo de los pacientes4. Además, los criterios de “vigilancia activa” se determinan mediante la cuantificación de la extensión del tumor y el grado de Gleason5. Dado que rara vez se realizan secciones completas en serie de núcleos de biopsia de próstata, podría producirse una subclasificación en casos con múltiples focos pequeños de adenocarcinoma de próstata, porque están presentes en diferentes niveles en los bloques de parafina5. Además, pueden producirse biopsias falsamente negativas debido a la sección incompleta de bloques de tejido. Por ejemplo, Paulk et al. demuestran la aparición de carcinoma de próstata en las secciones más profundas de los bloques de parafina que estaba ausente en las secciones iniciales de H&E5. En la práctica actual, es posible que no sea posible cortar de forma rutinaria todos los bloques de parafina para aumentar la visualización del tejido debido a la mayor carga de trabajo y al mayor precio, en comparación con el procedimiento estándar de seccionar solo 3 a 4 niveles.

En los últimos años, la microscopía de fluorescencia con lámina de luz (LSFM), junto con la limpieza óptica de tejido, se ha utilizado para la visualización en 3D y el examen de tejido humano y de roedores desde mesoescala hasta resolución de microescala6,7,8,9,10,11. Varios laboratorios han desarrollado protocolos de limpieza óptica, como CLARITY6,8, iDISCO9,10 y CUBIC12, que se han aplicado principalmente para hacer transparentes los cerebros de ratones, con el fin de comprender tanto la estructura como la patología del cerebro7. Sin embargo, la aplicación de imágenes de láminas de luz de tejido aclarado a grandes muestras de cerebro humano adulto de archivo (es decir, fijadas con fijadores de aldehído), en particular, ha sido un desafío importante debido al tamaño de la muestra y las dificultades de aplicar la limpieza, el etiquetado y la obtención de imágenes. en grandes volúmenes de tejido rico en mielina13.

Trabajos anteriores han demostrado una limpieza, etiquetado y obtención de imágenes LSFM exitosas tanto del cerebro humano7,12,13,14,15,16 como de biopsias de cáncer de próstata humano17. Sin embargo, aunque se limpiaron y etiquetaron con éxito muestras de cerebro humano de entre 1 mm313 y 1 cm312 y placas de tejido de 1,5 cm de espesor14, el tamaño real de la muestra obtenida con imágenes LSFM se ha restringido a placas de tejido de 1 mm3, 15 o 500 µm de espesor13 con un volumen máximo reportado de ~ 10,5 mm × 14,1 mm × 3 mm16. Zhao y cols. Se obtuvieron imágenes de la muestra de cerebro humano marcada y limpiada ópticamente más grande hasta la fecha (7,5 × 5 × 0,4 cm) con microscopía confocal. Sin embargo, una configuración de microscopía de lámina de luz aumentaría en gran medida la velocidad y la escalabilidad de la adquisición de imágenes. Estudios recientes de próstata, como los descritos y realizados por Glaser et al.17. se centró principalmente en biopsias con aguja gruesa de 1 a 2,5 mm. En la Tabla 1 se enumera una descripción general de las configuraciones LSFM más destacadas aplicadas a muestras de cáncer de próstata y cerebro humano (y otros tipos de muestras), incluido el volumen y la resolución de la muestra. Tanto el laboratorio Liu17 como el laboratorio Shroff18 han montado objetivos de inmersión múltiple para obtener imágenes de tejido aclarado en su LSFM abierto y en la microscopía de iluminación de plano selectivo invertido dual (diSPIM), respectivamente, para permitir la obtención de imágenes de tejido aclarado de, por ejemplo, Muestras de próstata humana y cerebro de ratón. Aunque esto muestra que la tecnología LSFM y los protocolos de limpieza están evolucionando rápidamente, hasta ahora las imágenes rápidas de tejido limpio en 3D de muestras de próstata y cerebro humanos a gran escala de muchos centímetros de tamaño lateral y muchos cm3 de volumen han permanecido fuera de nuestro alcance.

En este trabajo demostramos que limpiamos, etiquetamos y obtenemos imágenes ópticamente de varios centímetros cúbicos de muestras de tejido de cerebro humano y cáncer de próstata (secciones axiales de montaje completo). Anteriormente, presentamos MASH (tinción arquitectónica multiescala de la corteza humana), un enfoque escalable de limpieza y etiquetado que ha demostrado ser eficaz para placas de hasta 5 mm de espesor de tejido cerebral humano adulto de archivo. Aquí procesamos muestras de cerebro humano con limpieza y etiquetado MASH. Además, presentamos FFPE-MASH y, por primera vez, procesamos con éxito muestras de próstata humana FFPE. Luego presentamos el microscopio de iluminación de plano selectivo de vista dual de tejido limpio (ct-dSPIM) para realizar imágenes 3D LSFM de tejido limpio grande y eficiente, que supera con creces los estudios de muestras de próstata y cerebro humano LSFM eliminados existentes en el volumen de imagen.

Nuestro nuevo enfoque permite la obtención de imágenes en 3D, la visualización y la cuantificación de grandes volúmenes con alta velocidad y un equilibrio entre velocidad y resolución ajustable. Para mostrar la viabilidad de este método, describimos imágenes LSFM del cerebro y la próstata humanos. Utilizamos el ct-dSPIM para obtener imágenes del cerebro humano (lóbulo occipital) de hasta ~50 × 35 × 3 mm (>5 cm3) y de muestras de resecciones de cáncer de próstata humano (la sección axial completa después de la prostatectomía) de hasta ~40 × 35 × 5 mm (~7 cm3). Las imágenes ct-dSPIM permiten la extensión de los métodos y estudios actuales y permiten el examen de secciones axiales de próstata de montaje completo de varios mm de espesor. La aplicación de imágenes ct-dSPIM a muestras de cáncer de próstata más grandes permite obtener conocimientos tridimensionales novedosos sobre la morfología del tejido tanto benigno como neoplásico. Este conocimiento adicional en 3D sobre los tumores puede mejorar la visualización del tejido en todo el bloque, conducir a una mejor comprensión de la arquitectura del adenocarcinoma de próstata y posiblemente podría mejorar el diagnóstico del cáncer de próstata.

Hemos realizado imágenes 3D multiescala en el cerebro humano preparado con MASH (Figs. 1 a 5) y las secciones axiales de próstata de montaje completo (Figs. 6, 7; Figs. complementarias 1, 2) con un FoV grande con Mosaico 4 y Mosaico 16. adquisiciones y un FoV moderado y alta resolución para una región específica de intereses. El mosaico 16 de muestras de cerebro humano (Figs. 1, 2, 4) permitió realizar exploraciones generales a velocidad relativamente alta (aprox. 8–16 h, ~1,7 cm3/h, 16,4 µm isotrópicos, Tabla 2) de un bloque de tejido completo. a 5 cm × 3 cm de tamaño lateral y 3 mm de espesor. Se tomaron imágenes de regiones de interés más pequeñas de las muestras de cerebro humano con un Mosaic 4 (Figs. 3, 4). y Mosaico 0,5. (Figura 5). Presentamos y discutimos estos resultados a su vez.

a Muestra tomada aprox. 6 mm anterior al polo occipital (tercera sección de 3 mm de espesor en dirección posterior a anterior). De izquierda a derecha: muestra sin teñir fijada con formalina y muestra teñida con MASH-NR del lado anterior y posterior; muestra limpia tomada desde el lado posterior (la forma muestra características de la muestra transparente tanto en el lado anterior como en el posterior; cuadrícula: cuadrados más pequeños 1 × 1 mm, cuadrados en negrita 10 × 10 mm). Reconstrucción 3D de todo el corte con una resolución isotrópica de 16,4 µm con una adquisición Mosaic 16 (barra de escala: 1 cm): las capas ricas en células densamente teñidas son reconocibles incluso con vistas generales de bajo aumento/gran campo de visión (puntas de flecha blancas). El borde V1/V2 se indica mediante flechas negras en la descripción general y el ROI ampliado. b Corte anterior consecutivo del mismo lóbulo occipital aprox. 9 mm anterior al polo occipital, paneles como se describe en (a).

Representación 3D y planos ortogonales de datos isotrópicos de 16,4 µm. Vistas ortogonales de MIP de 50 m (XY: verde, XZ: rojo, YZ: azul) de toda la muestra de 3 mm de espesor. Barras de escala: 5 mm para XZ, YZ y renderizado de volumen respectivamente y 2,5 mm para el plano XY.

Representación 3D de las adquisiciones de Mosaic 4 de un ROI en las proximidades de la corteza visual primaria humana (arriba a la izquierda). Las vistas ortogonales de MIP de 50 µm (XY: azul, XZ: verde, YZ: rojo) muestran capas corticales independientes de la orientación (flechas blancas). Los bordes irregulares en la vista XZ se deben a la desviación cuando el borde de la adquisición está dentro del tejido. Los ROI ampliados del MIP (XY: amarillo, XZ: magenta, YZ: cian) demuestran cualitativamente la resolución muestreada isotrópicamente y la calidad de imagen y etiquetado en lo profundo de la muestra. Barras de escala: Representación de volumen, plano XY e YZ de 3 mm; XZ: 1,5 mm; ROI ampliadas 0,5 mm, respectivamente.

Los datos adquiridos de todo el corte del lóbulo occipital (tercera sección de 3 mm de espesor desde el polo occipital hacia la dirección anterior) se muestran con una resolución de 16,4 µm (volumen de 16,4 µm; lado izquierdo). Se tomaron imágenes de dos circunvoluciones con una resolución de 4,1 µm (azul) y en el volumen de 0,5 µm (rojo) con una resolución anisotrópica, con un tamaño de píxel de 0,725 µm × 0,5127 µm × 0,5127 µm. Las inserciones ampliadas demuestran la resolución efectiva que se puede lograr con el volumen de 4,1 µm (magenta) y el volumen de 0,5 µm (naranja), respectivamente. Si bien el volumen de 4,1 µm muestra estructuras mesoscópicas indicativas de minicolumnas (resaltadas en magenta), puede ser difícil diferenciar células individuales más pequeñas de grupos de células con esta resolución en la corteza visual koniocelular extremadamente densamente poblada. El volumen de 0,5 m permite la identificación de células individuales, incluidas las partes proximales de las dendritas apicales y basales (flechas blancas). Barras de escala: 5 mm (volumen de 16,4 µm), 3 mm (volumen de 4,1 µm) y 0,25 mm (volumen de 4,1 µm, panel ampliado), 1 mm (volumen de 0,5 µm) y 0,075 mm (volumen de 0,5 µm, panel ampliado).

a Representación en volumen del conjunto de datos utilizado para el recuento de células. b Resultados de la segmentación manual de capas para todo el volumen. Los colores son los siguientes: Capa I cian, Capa II rojo brillante, Capa IIIa naranja, Capa IIIb verde, Capa IV magenta, Capa V azul, Capa VI rojo oscuro y materia blanca en amarillo. El tejido en la parte no segmentada del volumen estaba dañado y no permitía la segmentación de capas y fue excluido del análisis. Plano único (plano XY del volumen de imagen rebanado) de los datos filtrados (c) y objetos segmentados automáticamente (d). Las celdas segmentadas se muestran en colores aleatorios. e Estimaciones de densidad de celdas derivadas del recuento total de todas las celdas segmentadas por segmento de capa en todo el volumen de la imagen (para múltiples segmentos no conectados de las mismas capas, los recuentos se agruparon). Colores como se indica para (b). Las barras de escala para todas las imágenes en el lado izquierdo son de 500 µm y para los dos paneles ampliados de 75 µm.

Las muestras se muestran en varias etapas durante el proceso de procesamiento en el lado izquierdo: después de la desparafinación y el blanqueo (a, e), después de la tinción (b, f) y después de la compatibilidad con RI (es decir, aclarada, c, g). En el lado derecho, un MIP del conjunto de datos Mosaic 16 de aprox. 50 µm se muestran en escala de grises invertida (d, h). Los círculos rojos indican las regiones cancerosas (identificadas por un patólogo). Abreviaturas: estroma fibromuscular anterior AFS, zona central CZ, uretra U (prostática), zona periférica PZ, zona de transición TZ. Barras de escala: 3 mm.

La muestra de la Fig. 8e-h se muestra aquí en 2D (a, una capa en toda la superficie en yz que se muestra en el cuadro rojo, incluidas 2 secciones ortogonales en todo el espesor de la muestra indicada en verde (xz) y azul (xy ) cuadros. Los cuadros discontinuos indican el tumor (identificado por el patólogo). La región del tumor de esta muestra (cuadro discontinuo rojo en a) también se muestra en b como una representación de volumen 3D. Barra de escala: a, 3 mm; b, uno cuadrado de la rejilla roja 1 mm.

Se tomaron cortes gruesos del lóbulo occipital del cerebro humano (Fig. 1) de aprox. 6 mm anterior al polo occipital (tercera sección de 3 mm de espesor en dirección posterior a anterior; ver Fig. 1a y Video complementario 1) y el corte anterior consecutivo (~ 9 mm anterior al polo) del mismo lóbulo occipital (Fig. 1b y vídeo complementario 2). Las decoloraciones oscuras en las rebanadas sin procesar (paneles del extremo izquierdo) probablemente se debieron a la acumulación post-mortem de sangre en los vasos de la parte posterior de la cabeza. Las rodajas teñidas muestran la franja de Gennari en V1 (Fig. 1, indicada por flechas). La morfología de la muestra aclarada por MASH se conserva bien después de la deshidratación, la deslipidación y la coincidencia del índice de refracción (RI), y tanto la materia gris como la blanca se vuelven altamente transparentes. La contracción del tejido observada en las muestras eliminadas de MASH es relativamente menor, con una reducción media en el área de superficie medida del 12% (Figura 3 complementaria). Los artefactos negros en la Fig. 1a se derivan de la dispersión de la luz al tomar imágenes del pegamento caliente utilizado para fijar la muestra en la cámara de imágenes impresa en 3D. Esto ocurre cuando la capa grabada más profunda del volumen de la imagen se extiende sobre el tejido y hacia el pegamento que se encuentra debajo.

Utilizamos las muestras del lóbulo occipital que se muestran en la Fig. 1 para obtener imágenes ct-dSPIM multiescala. Primero, realizamos una exploración general del Mosaico 16 de la muestra completa (consulte las figuras 1, 2, 4 y el video complementario 3). La Figura 1 muestra la reconstrucción 3D de ambos cortes con un volumen de datos Mosaic 16 con una resolución isotrópica de 16,4 µm. La dirección de escaneo se puede reconocer como la dirección de las largas pilas o franjas de imágenes (cada una de 0,74 × 0,74 mm de profundidad y ancho y muchos centímetros de largo), que están dispuestas en mosaico en las dos direcciones restantes para proporcionar una cobertura completa de la muestra 3D. Se pueden distinguir varias capas corticales por sus diferencias en la densidad celular (Fig. 1, puntas de flecha blancas) y el borde V1/V2 es visible en esta resolución mesoscópica como un claro cambio en el patrón de las capas (Fig. 1, flechas negras).

En la Fig. 2, se muestran representaciones de volumen y proyecciones de intensidad máxima (MIP) ortogonales para visualizar mejor la cobertura de volumen obtenida. Los diferentes ejes (etiquetados en el visor de imágenes, consulte la figura complementaria 4) se indican en verde (XZ), rojo (YZ) y azul (XY) respectivamente. La vista XY muestra el mosaico de las pilas de adquisición largas en la dirección Z del volumen (correspondiente al eje X del escenario durante la adquisición). Las vistas ortogonales también resaltan la penetración y la calidad de la etiqueta en toda la muestra de 3 mm de espesor.

Después de adquirir la descripción general Mosaic 16, se realizó una exploración Mosaic 4 con resolución isotrópica de 4,1 µm de mayor resolución en una ROI cerca del borde V1/V2 (Figs. 3, 4). Las vistas ortogonales de MIP de 50 µm se indican mediante paneles verdes (XY), rojos (XZ) y azules (YZ) respectivamente y muestran diferencias en las capas corticales independientemente de la orientación (Fig. 3, flechas). Los recuadros de mayor aumento (XY: amarillo, XZ: magenta, YZ: cian) son un retorno de la inversión del MIP y demuestran cualitativamente una resolución casi isotrópica (muestreada isotrópicamente a 4,1 µm, pero anisotrópica ópticamente debido a una lámina de luz de ~8 µm de espesor) y alta calidad de imagen y etiquetado incluso en lo más profundo de la muestra (Fig. 3). Las características corticales mesoarquitectónicas, como las minicolumnas, se vuelven bien visibles con esta resolución (Fig. 4, panel magenta) y se pueden distinguir capas corticales más delgadas, que no son visibles en los datos del Mosaico 16. La mayor resolución incluso hace posible distinguir algunas de las células individuales más grandes (Figs. 3, 4, paneles ampliados), a pesar de la granularidad de la corteza occipital.

Para demostrar el potencial de las imágenes cerebrales volumétricas para la histología cuantitativa en 3D, realizamos un recuento celular automatizado en un volumen de alta resolución de 0,5 µm (suplementario. Vídeo 4) (Fig. 5; tamaño de vóxel: 0,725 µm × 0,5127 µm × 0,5127 µm). El objetivo era comparar cuantitativamente las densidades celulares en las diferentes capas corticales. Todo el volumen (Fig. 5a) de un conjunto de datos enderezados, cosidos y rebanados se segmentó manualmente en las diferentes capas corticales (Fig. 5b). La segmentación de capas no se pudo realizar satisfactoriamente en una región del conjunto de datos, que contenía tejido dañado. Por lo tanto, esta región fue excluida del análisis (partes sin colorear en la Fig. 5b). Posteriormente, los datos se procesaron en un proceso automatizado para filtrar las imágenes sin procesar y segmentar los cuerpos celulares (Fig. 5c, d). El número de todos los segmentos de células, mayores de 125 µm3 y completamente contenidos dentro del segmento de capa correspondiente, se utilizó para derivar estimaciones de densidad celular para cada capa (Fig. 5e). Los recuentos de células se agruparon para capas con múltiples segmentos desconectados. Como era de esperar, la capa I muestra la densidad celular más baja con poco más de 60.000 objetos segmentados por mm3, aunque la densidad es mayor de lo esperado para esta capa. La capa II, aunque muestra densidades celulares más altas que la capa I o IIIa (como se esperaba), muestra una densidad más baja de lo esperado a partir de la impresión cualitativa durante la segmentación de la capa. Sorprendentemente, las capas IIIb, V y VI tenían densidades celulares más altas que las capas II o IIIa. La capa IV, que es visiblemente, con diferencia, la capa más densa, también exhibió la densidad celular más alta en nuestro conjunto de datos, con casi 100.000 objetos segmentados por mm3. Es probable que varias de estas observaciones se expliquen, al menos parcialmente, por efectos de volumen parcial. Para validar los resultados de la segmentación automatizada, realizamos un recuento celular manual en el mismo conjunto de datos. El método de segmentación celular automática empleado se empleó con un sobreconteo promedio del 36%, en comparación con los conteos manuales (consulte la Figura complementaria 5). Esto se alivió parcialmente, pero no del todo, mediante la exclusión de segmentos que se consideraban demasiado pequeños para representar células (<125 µm3). Después de filtrar estas pequeñas estructuras, los segundos resultados automatizados sobreestimaron en un promedio del 17%. Se observó que las células especialmente grandes en la segmentación automática a menudo se segmentaban en múltiples objetos más pequeños cuando había diferencias de intensidad visibles en todo el citoplasma o entre el núcleo y el nucleolo del citoplasma.

Desarrollamos FFPE-MASH para secciones axiales de próstata humana fijadas con formalina e incluidas en parafina (FFPE). Por primera vez, el protocolo MASH con la etiqueta MASH-NR se ha aplicado con éxito a muestras grandes de cáncer de próstata de diferentes pacientes (las secciones axiales de montaje completo; Figs. 6, 7; Figs. 1, 2 complementarias; Video complementario 5) . Por lo tanto, demostramos la viabilidad de la aplicación de MASH no solo en tejido de órganos humanos distintos del cerebro, sino también en material FFPE. Además, pudimos demostrar la viabilidad de imágenes Mosaic 16 ct-dSPIM de alta velocidad (1,7 h/1 cm3) en grandes muestras de cáncer de próstata marcadas y aclaradas con MASH-NR. Las grandes revisiones mesoscópicas permiten la descripción anatómica de la morfología del tejido prostático y la indicación de posibles regiones neoplásicas (Fig. 6d, h; indicadas por círculos rojos), que se confirmó que era un adenocarcinoma de próstata mediante histopatología. La evaluación microscópica de los correspondientes cortes de hematoxilina-eosina mostró que el tumor está formado por glándulas neoplásicas cribiformes y fusionadas, compatibles con un adenocarcinoma de próstata de alto grado. En el volumen del Mosaico 16 (Fig. 6d, h) se podrían clasificar diferentes zonas de capas y compartimentos de la glándula prostática, a saber, el estroma fibromuscular (AFS), la zona central (CZ), la zona periférica (PZ), la transición zona (TZ) y la uretra (U). Además, las exploraciones Mosaic 4 de mayor resolución permitieron la detección de la morfología del tumor en toda la muestra de tejido y el patólogo sugirió una puntuación de Gleason de 3 y 4 en la sección de montaje axial completo (prostatectomía) (Figura complementaria 2).

La visualización 3D del ct-dSPIM obtuvo imágenes de las secciones axiales de próstata de montaje completo (Fig. 7; Fig. complementaria 2) permite la detección del corte transversal de la uretra prostática, que se muestra en las secciones ortogonales en todo el espesor de la muestra. (Fig. 7a, cuadro verde y azul, el inserto discontinuo indica la región del tumor). El volumen 3D que se muestra en la Fig. 7 también muestra la región cancerosa, indicada con la línea discontinua roja en una vista de superficie, según lo confirmó un patólogo. Las regiones tumorales también se indican en la sección ortogonal de la Fig. 7a en la línea discontinua verde y azul. La Figura 7b muestra una magnificación superior en 3D de la región del tumor que se muestra en el cuadro de línea discontinua roja en a.

Aquí presentamos el novedoso prototipo ct-dSPIM para obtener imágenes de láminas de luz de tejido aclarado de muestras de tejido humano a gran escala y nuestra aplicación a secciones axiales de montaje completo tanto del cerebro humano como de la próstata (después de la prostatectomía). Pudimos demostrar la eficiencia y viabilidad de las imágenes ct-dSPIM con resecciones del lóbulo occipital humano de archivo preparadas por MASH19 (Figs. 1 a 5) y de próstata (prostatectomía; Figs. 6, 7). El protocolo FFPE-MASH19 con el etiquetado MASH-NR se aplicó con éxito por primera vez a muestras grandes de cáncer de próstata fijadas con formalina e incluidas en parafina (FFPE), como se muestra en las Figs. 6 y 7, así como en las Figs complementarias. 1 y 2 y la película complementaria 5. Esto no solo muestra la aplicabilidad de MASH a otros tipos de tejidos además del cerebro humano sino, igualmente importante, a muestras FFPE además de muestras fijadas con formalina. Anteriormente, aplicamos el protocolo MASH a muestras de cerebro humano de archivo fijadas con formalina que se mantuvieron en PFA al 4% hasta su uso. El uso del protocolo MASH en material FFPE podría aumentar su aplicación en otros dominios, ya que el tejido FFPE se ha utilizado comúnmente en investigación y aplicaciones clínicas durante décadas, lo que significa que el efecto potencial en la práctica clínica es considerable. El paso más importante en la modificación de MASH hacia tejido FFPE es la desparafinación inicial en xileno, que debe ser lo suficientemente larga como para permitir la completa disolución de la parafina en muestras espesas. Por lo tanto, este paso podría omitirse mediante la aplicación de esta técnica en muestras frescas, sin fijaciones previas y procesamiento con parafinización, lo que aceleraría considerablemente el tiempo de procesamiento del tejido MASH.

Además de revisar las adquisiciones de Mosaic 16 con una resolución isotrópica de 16,4 µm, hemos adquirido escaneos de mayor resolución dentro de regiones de interés específicas. Mientras que Mosaic 16 proporciona una descripción general del bloque de tejido completo, Mosaic 4 (resolución isotrópica de 4,1 µm) y Mosaic 0,5 (resolución cercana a 1 µm) permiten una evaluación más detallada de partes del mismo tejido. En conjunto, este esquema de adquisición de datos multiescala permite la identificación de diferentes características mesoscópicas, como capas, minicolumnas y cuerpos celulares en el cerebro (Fig. 4). Esto permite el análisis completo y detallado de grandes muestras de tejido humano.

El muestreo isotrópico de los conjuntos de datos Mosaic 16 y Mosaic 4 se basa en una relación √2 entre la longitud del paso del corte y la resolución de muestreo lateral y está ópticamente limitado por la resolución axial, es decir, por el espesor teórico de la lámina de luz de ~8 µm. La velocidad de adquisición general de los escaneos Mosaic solo está limitada por la velocidad máxima de escaneo de la etapa y actualmente varía de 1,7 h/~1 cm3 para Mosaic 16 a 5 h/~1 cm3 para Mosaic 4 y 15,8 h/~1 cm3 para Mosaic 0.5 . Las exploraciones generales de Mosaic 16 permitieron la visualización de gran volumen y alta velocidad de una placa completa de tejido de prostatectomía de 5 mm o de una placa completa de tejido del lóbulo occipital humano de 3 mm. Aquí, mostramos escaneos en mosaico de las muestras occipitales con una duración de adquisición entre 2 h 23 min (Mosaico 0,5), 3 h 45 min (Mosaico 4) y hasta 8 h 26 min de toda la muestra de occlobe grande de 5 cm3 (Mosaico 16; Figuras 1 a 5). El tiempo para adquirir una capa superficial del escaneo Mosaic 16 de una muestra de próstata, como se muestra en la Fig. 6, fue de 50 minutos.

En el futuro, el método podría superar los límites actuales de resolución. En teoría, es posible realizar imágenes ct-dSPIM de vista dual con resolución óptica efectiva de ~ 1 µm, lo que se ha demostrado principalmente en cultivos celulares. Muy recientemente, han surgido demostraciones en tejido aclarado18,20 que aplican imágenes de vista dual y el posterior procesamiento de deconvolución de vista dual mediante fuertes aceleraciones del procesamiento de deconvolución. Sin embargo, incluso en los desarrollos más recientes20, donde la deconvolución se implementa mediante un aprendizaje profundo informado por el proceso de formación de imágenes, los tiempos de procesamiento siguen siendo del orden de unas pocas horas (2 a 3 h) para volúmenes tres órdenes de magnitud más pequeños (1,4 × 2,3 × 0,5 mm3) que los reportados aquí, lo que implica miles de horas de procesamiento para las muestras muy grandes presentadas aquí incluso con los métodos actuales más avanzados. Además, las adquisiciones de doble vista duplicarían los tiempos de adquisición actuales, lo que haría que el costo de tiempo total para la mejora de la resolución fuera considerable y poco realista en el contexto relevante de muestras de tejido muy grandes y la futura aplicación clínica en la próstata. Además, para los fines de este estudio, con el objetivo de obtener imágenes FoV grandes, eficientes y escalables con una resolución suficiente (en lugar de la resolución ópticamente limitada más alta posible), el análisis de costo/beneficio y la viabilidad en términos de tiempo total hacen que actualmente las imágenes de vista dual desfavorable. En nuestro estudio actual, hemos incluido datos de imágenes de mosaico ct-dSPIM de un subvolumen del cerebro humano (lóbulo occipital) con una resolución (muestreada) de 0,725 µm × 0,5127 µm × 0,5127 µm. Aunque la resolución óptica real es menor (del orden de 8,0 µm × 0,8 µm × 0,8 µm con el objetivo de 0,4 NA), estos datos de vista única pueden adquirirse a velocidades de datos razonables y son suficientes para los fines previstos, incluida la detección de células individuales. segmentación y recuentos cuantitativos de células en muestras de cerebro humano. En muestras de cáncer de próstata, una resolución de muestra que oscila entre 16 y 0,5 µm permite obtener imágenes tumorales en 3D eficientes con una calidad de imagen suficiente para la investigación clínica (Figs. 8, 9; Figs. complementarias 4, 5). Para trabajos futuros vemos oportunidades (p. ej., resolución subcelular para estructuras intracelulares o estructuras neuronales axonales o dendríticas) y la posibilidad de combinar nuestros esfuerzos actuales con una resolución casi isotrópica más alta. En tales esfuerzos, tanto los enfoques desconvolucionados de vista dual como los enfoques de exploración axial de vista única merecerán consideración para muestras grandes de imágenes de cerebro y próstata21,22.

Una representación 3D de la cámara de imágenes más grande que se utiliza habitualmente en la configuración ct-dSPIM. Las cámaras tienen un volumen de 0,9 l (20 cm × 15 cm × 3 cm). La cámara se muestra en vista superior (arriba), oblicua (en medio) y lateral (abajo). b Prototipo de cámara impreso con SLS en PP. c Prototipo de cámara impreso con SLA en Somos®WaterShed XC 11122. Las muestras se montan sobre portaobjetos de vidrio, que se sellan con silicona para evitar que la cámara pierda RIMS.

a La luz láser emitida se colima y pasa a través de una lente sintonizable electrónicamente (ETL) (C60-TUNELENS-100, ASI) hacia el “escáner” de lámina de luz (MM-SCAN-1.2, ASI). El ETLf permite controlar electrónicamente la posición axial de la cintura del haz en la muestra. La leyenda continúa en la página siguiente. El escáner contiene un espejo MEMS 2D, que barre el haz gaussiano a través de la muestra una vez por imagen de la cámara para formar una hoja de luz "virtual" o "digital". El otro eje del espejo MEMS se utiliza para ajustar la hoja de luz coincidente con el plano focal del objetivo de detección. b Las rutas de imagen son las dos rutas de luz posibles (rutas A y B). Para cada ruta, el escáner está en un lado y el piezoeléctrico de imágenes y la cámara están en el lado opuesto. La luz viaja a través de los diferentes componentes, como el espejo dicroico y el filtro de emisión, como se muestra (rutas de excitación: línea punteada azul; rutas de emisión: línea verde continua). La fluorescencia filtrada se enfoca en una cámara sCMOS de 2048 × 2048 píxeles (ORCA-Flash4.0 V3, Hamamatsu) mediante una lente de tubo (C60-TUBE-B, ASI; f = 200 mm).

Uno de los aspectos prometedores de las imágenes volumétricas que se muestran en este artículo es el hecho de que nos permite obtener imágenes de un gran volumen de corteza humana con una alta resolución espacial, lo que a su vez nos permite investigar estructuras celulares en campos de visión extendidos. En el futuro, esto podría permitir, en principio, cuantificar las densidades celulares para diferentes áreas y capas sin sesgos estereológicos, ya que los recuentos celulares derivados no son extrapolaciones de secciones 2D. Sin embargo, en este punto, las estimaciones de densidades celulares derivadas estereológicamente aún deben considerarse el estándar de oro, ya que están bien establecidas. Por lo tanto, es interesante cómo nuestros resultados de conteo y segmentación 3D se relacionan con los datos estereológicos en la literatura. Desafortunadamente, las estimaciones de la densidad celular en la corteza visual secundaria humana son raras. Las estimaciones que se han calculado con métodos estereológicos, como el fraccionador isotrópico23, generalmente se dan en células por gramo de tejido cerebral y no es sencillo convertirlas a nuestras estimaciones de volumen.

Leuba y Garey24 encontraron un número promedio de células en el área V2 de 14,7600 bajo un área cortical de 1 mm2, o 63,700 células/mm3. La densidad celular total en nuestro conjunto de datos en todas las capas fue de 81.903 células/mm3. Se considera poco probable que estos recuentos de células más altos en nuestros datos surjan de la eliminación de la contracción del tejido inducida, ya que el cambio observado en el tamaño de nuestras muestras es relativamente menor (consulte la Figura complementaria 3). Esto es especialmente cierto en comparación con otros métodos de limpieza de tejidos basados ​​en disolventes, que muestran una contracción del tejido mucho mayor, del 30%14 o incluso hasta el 50%25. Si tomamos en cuenta el sobreconteo observado de la segmentación celular automatizada de, en promedio, 17% (Figura complementaria 5), ​​nuestros recuentos de células corregidos de 67,980 células/mm3 están relativamente cerca de Leuba y Garey. Cuando nos centramos en las capas individuales, nuestra densidad celular en la capa IV generalmente concuerda con Leuba y Garey con 97,529 células/mm3 (nuestros datos) versus 10,7316 células/mm3 24 Para derivar las densidades de todas las células, multiplicamos sus densidades reportadas. números de neuronas con su relación neurona/glia informada y agregaron estas dos poblaciones, ya que solo proporcionan densidades de población de células completas para toda el área, pero no en su tabla específica de capa. Desafortunadamente, Leuba y Garey no enumeran las densidades de todas las capas, pero informan las capas supragranulares II y III, así como las capas infragranulares V y VI juntas. Reportan una densidad celular supragranular de 63.558 células/mm3, que es similar al número de células que encontramos en la capa IIIa (66.884 células/mm3). Sin embargo, tanto la capa II (71.599 células/mm3) como la IIIb (82.712 células/mm3) muestran un mayor número de células y, por tanto, la densidad celular supragranular combinada es también mayor, con 77.807 células/mm3. Como se mencionó anteriormente, la densidad celular muy alta observada en la capa IIIb fue sorprendente, dada la apariencia visual de esa capa como menos densa con neuronas piramidales más dispersas y más grandes. Una posible explicación para esta discrepancia podría ser un efecto de volumen parcial de la muy densa capa adyacente IV, que surge de una segmentación manual imperfecta de la capa. Otro factor que probablemente contribuya podría ser una tendencia observada en la segmentación celular automatizada a dividir las neuronas más grandes en múltiples segmentos cuando muestran diferencias de intensidad en su volumen citoplasmático (consulte la figura complementaria 5). Esta tendencia a segmentar células más grandes en múltiples segmentos condujo a un recuento excesivo promedio de la segmentación celular automatizada de aproximadamente el 17 %, después de que se filtraron los segmentos menores de 125 µm3. Si tenemos en cuenta este recuento excesivo, el recuento combinado de células supragranulares de 64.580 células/mm3 está considerablemente más cerca de Leuba y Garey. Ambos factores también podrían explicar las mayores densidades celulares observadas en nuestros datos para las capas V, ya que la alta densidad de la capa V (88.781 células/mm3) fue igualmente inesperada. Los efectos del volumen parcial no pudieron explicar la densidad igualmente alta de la capa VI (81.904 células/mm3), aunque la división de los cuerpos celulares grandes probablemente aún conduzca a un recuento excesivo. Por lo tanto, nuestra densidad celular infragranular combinada es sustancialmente mayor que la informada por Leuba y Garey (86.579 células/mm3 frente a 53.658 células/mm3). Incluso si tenemos en cuenta el recuento excesivo de la segmentación automatizada, nuestras densidades de células infragranulares observadas serían mayores que las de Leuba y Garey (71.861 células/mm3). Las mejoras en la calidad de la segmentación podrían aliviar al menos algunas de estas discrepancias y acercar las estimaciones de las células en esta área a las estimaciones estereológicas. Zhao y cols. utilizar una segmentación basada en aprendizaje profundo sobre datos volumétricos del cerebro humano despejado14. Cabe señalar que los autores de este artículo informan densidades mucho más altas (16.2000–21.6000 células/mm3) que Leuba y Garey o el trabajo aquí informado, aunque no investigaron áreas diferentes.

Un posible aspecto que podría explicar la variación del número de células entre estos enfoques es también la cantidad de contracción introducida durante el procesamiento histológico. Dado que el enfoque de limpieza de tejidos utilizado en este estudio es diferente al de Zhao et al. 26, y se sabe que produce una contracción relativamente menor (12 % en comparación con el 30 % informado en Zhao et al.; consulte la figura complementaria 3), esto podría explicar, al menos en parte, esta discrepancia. Otro estudio publicado recientemente que aplicó un sistema de segmentación celular muy sofisticado27 llegó nuevamente a resultados muy diferentes con densidades neuronales de 14.000 a 24.000 neuronas/mm3 (lo que significa alrededor de 28.000 a 47.500 células/mm3 cuando se aplica la relación neurona/glia de Leuba y Garey). El enfoque de limpieza utilizado en este estudio es un protocolo de limpieza de tejido acuoso, que expande el tejido. Esto, a su vez, podría explicar las estimaciones más bajas. Además, se basan en el etiquetado de anticuerpos para identificar poblaciones de células neuronales, en lugar de un tinte orgánico más general con un peso molecular más pequeño, lo que también podría explicar algunas de las diferencias observadas. Por último, también es posible que el método estereológico 2D implementado por Leuba y Garey conduzca a un recuento insuficiente sistemático, al extrapolar los recuentos de células 2D en secciones a un gran volumen de tejido.

El diagnóstico histopatológico clásico del cáncer de próstata, en particular de los tumores multifocales, supone un desafío3. Además, la evaluación de toda la biopsia central, o la resección de toda la muestra, llevaría hasta 10 días, lo que es ineficiente y muy costoso, y casi nunca se realiza en la práctica clínica estándar. Por lo tanto, las posibles imágenes Mosaic ct-dSPIM de la próstata, en colaboración con oncólogos y patólogos del hospital local, abren nuevas vías para futuros diagnósticos de cáncer.

Trabajos recientes han demostrado la utilidad de LSFM para examinar biopsias con aguja central de próstata humana de 1 a 2,5 mm de espesor mediante un sistema LSFM abierto de construcción casera. En cambio, aquí se examinaron secciones completas de próstata axiales de 5 mm de espesor con exploraciones Mosaic 16 y 4 ct-dSPIM en aproximadamente 10 minutos. 1 a 5 h, lo que ahorra tiempo y permite una evaluación general relativamente rápida de toda la biopsia (Figs. 6, 7; Figs. 1, 2 complementarias; Video complementario 5). Además, esto permite un examen retrospectivo de un número muy elevado de muestras archivadas de cáncer de próstata (hasta 8 muestras por día). Las imágenes 3D de alto volumen pueden permitir la visualización de tumores en capas o regiones más profundas y en toda la muestra gruesa de resección de próstata. Esto tiene el potencial de proporcionar nuevos conocimientos sobre la estructura del tejido prostático tanto canceroso como benigno. Hasta la fecha, la información actual sobre la arquitectura 3D de la próstata es limitada, ya que se basa en exámenes de resonancia magnética, que no permiten un análisis detallado y de alta resolución del órgano completo, incluida la formación de glándulas, la luz y la capa epitelial. Sin embargo, en la práctica histopatológica actual, la técnica más utilizada es una combinación de microscopía clásica de campo brillante y tres o cuatro niveles de secciones de tejido de 5 µm de espesor, lo que da como resultado información de tejido 2D. Esto puede llevar a una subclasificación del tumor o a un diagnóstico falso negativo en el caso del carcinoma multifocal, porque estos están presentes principalmente en los niveles profundos de los bloques de tejido. Por lo tanto, es de gran valor para el patólogo y el oncólogo obtener información novedosa de alto volumen y alta resolución en 2D y 3D sobre la arquitectura detallada del tumor de próstata utilizando muestras de próstata de pacientes de 5 mm de espesor (Figs. 6, 7; Figs. complementarias 1, 2). ; Vídeo complementario 5). Las imágenes cuantitativas con láminas de luz de esas muestras más gruesas de cáncer de próstata (prostatectomía) pueden mejorar la precisión del diagnóstico. Los resultados de este estudio muestran que es posible detectar tumores con nuestro método de imágenes ct-dSPIM de tejido aclarado e incluso permitir la clasificación de la puntuación de Gleason (Figura 2 complementaria), incluida la detección del proceso neoplásico y distinguir el tejido prostático benigno normal. de adenocarcinoma. Tanto las exploraciones Mosaic 16 (Figs. 6, 7) como Mosaic 4 (Figs. 1, 2 complementarias; Video complementario 5) permitieron la detección de tumores en la sección axial de próstata de montaje completo de diferentes pacientes.

Además, dado que las adquisiciones de Mosaic en ct-dSPIM permiten el examen 3D de alta velocidad de muestras de próstata a gran escala, es factible desarrollar procesos de obtención de imágenes de alto rendimiento, durante aprox. 20 muestras en 10 días, si solo se toma la imagen de una muestra a la vez. El procesamiento estándar de la próstata incluye al menos 24 h de fijación, seguido de extracción macroscópica y procesamiento en un procesador de tejido de infiltración al vacío (al menos 24 h). Por lo tanto, este paso podría omitirse mediante la aplicación del enfoque MASH y ct-dSPIM propuesto en una muestra de resección fresca. Potencialmente, esto podría tener un efecto considerable en la práctica clínica y acelerar el flujo de trabajo de diagnóstico. Dado el tamaño del contenedor de imágenes (ver Fig. 8), se podrían acomodar varias muestras en paralelo en el ct-dSPIM, lo que podría hacer que las imágenes sean aún más eficientes. Esto puede dar como resultado una rápida recopilación de conocimientos y es factible para varias muestras de pacientes en diferentes etapas de la enfermedad, al tiempo que proporciona datos suficientes para las estadísticas y la cuantificación de la variación y localización del tumor.

En resumen, nuestro método tiene el potencial de mejorar la obtención de imágenes de muestras de resecciones de cáncer de próstata humano. Proporciona una novedosa visualización 3D de toda la muestra en detalle, lo cual no es factible en tiempo y recursos con los métodos tradicionales. También podría conducir a imágenes de próstata más rápidas, lo que tiene beneficios para la eficiencia de la práctica clínica, además de generar nuevas oportunidades para la investigación (de tejido de archivo). Además, podría proporcionar diagnósticos más precisos, especialmente en carcinomas multifocales.

Demostramos imágenes en mosaico a gran escala en el sistema ct-dSPIM y demostramos que podíamos superar las limitaciones de otros microscopios de láminas de luz existentes para una cobertura de muestras humanas muy grandes16,28. El ct-dSPIM utiliza una geometría oblicua con los objetivos sumergidos directamente en el líquido de imágenes desde arriba, a diferencia de otras configuraciones publicadas recientemente17,28. En sistemas anteriores, los objetivos están ubicados debajo de la muestra, lo que requiere obtener imágenes a través del fondo de vidrio de la cámara. El tamaño de la muestra está potencialmente limitado aún más por esta geometría, ya que la distancia de trabajo (WD) se pierde efectivamente al obtener imágenes a través del vidrio y una lente adicional. Otros sistemas utilizan una geometría de lámina de luz más estándar (es decir, vertical, no oblicua) y utilizan una forma novedosa de generar la propia lámina de luz para obtener imágenes de muestras muy grandes11. En estos sistemas, la extensión lateral será finalmente limitada, ya que incluso en las muestras más transparentes, se producirá cierta dispersión de la luz y la calidad de la imagen en las zonas más profundas del tejido se deteriorará. Esto se puede evitar con una configuración oblicua como el ct-dSPIM, dejando el tamaño lateral de la muestra limitado únicamente por el rango de recorrido de la platina del microscopio.

Otros cambios de hardware, como un escáner de lente cilíndrica (en lugar de una hoja de luz láser escaneada digitalmente) y ajustes de trayectoria de mosaico del escenario, como una trayectoria serpenteante, podrían potencialmente aumentar aún más la velocidad de obtención de imágenes de 2 a 4 veces. Esto abriría una escala completamente nueva en la investigación del tejido cerebral sano y enfermo post mortem. Otras modificaciones de hardware de la configuración ct-dSPIM, como objetivos de aumento y NA más altos, así como un enfoque de hoja de luz escaneada axialmente, podrían permitir un aumento en la resolución de las imágenes a costa del campo de visión o del tiempo para imagen del mismo tamaño de muestra. Estos desarrollos futuros podrían permitir obtener imágenes de diferentes estructuras y marcadores en partes más grandes del cerebro, con el potencial de proporcionar conocimientos novedosos sobre la neuroanatomía humana sana y patológica.

Además, establecer opciones de etiquetado adicionales, como el etiquetado de moléculas pequeñas de la angioarquitectura cerebral, así como estrategias de etiquetado de anticuerpos que también sean adecuadas para la obtención de imágenes de muestras grandes con ct-dSPIM, podría ampliar aún más las posibilidades. En el futuro, todo el proceso, desde el procesamiento de tejidos (con limpieza y etiquetado MASH) hasta las imágenes en mosaico ct-dSPIM y el análisis de datos, podría extenderse a partes más grandes del cerebro y regiones cerebrales, como todo el lóbulo temporal u occipital en 3– Losas de 5 mm de espesor. Como el tamaño de la muestra lateral puede ser potencialmente mucho mayor en la configuración actual, incluso sería posible obtener imágenes de cortes de cerebro completos, siempre que se establezca un proceso de procesamiento de tejidos para muestras de este tamaño.

Aunque demostramos el uso de próstata y humanos preparados con MASH como casos de aplicación para adquisiciones a gran escala en el ct-dSPIM, esta técnica también podría extenderse a una variedad de otros tejidos humanos y de mamíferos no humanos. Esto podría hacer que la combinación de MASH con imágenes ct-dSPIM sea una herramienta poderosa para estudios anatómicos y patológicos en general.

En conclusión, pudimos demostrar que el ct-dSPIM es una excelente herramienta para obtener imágenes cuantitativas eficientes de láminas de luz en 3D de muestras de tejido humano de gran tamaño. Pudimos mostrar la aplicación de imágenes ct-dSPIM a muestras de cerebro humano post mortem (lóbulo occipital) y de cáncer de próstata (secciones axiales de próstata de montaje completo) a escala cm3 ópticamente aclaradas. Mediante una descripción general rápida y seguida de escaneos en mosaico de alta resolución de las regiones de interés identificadas, pudimos realizar un recuento de células cerebrales humanas en las muestras del lóbulo occipital y una clasificación de la puntuación de Gleason en las secciones axiales de próstata de montaje completo. En el futuro, las imágenes ct-dSPIM tienen el potencial de aplicarse en investigaciones clínicas y fundamentales más amplias de muestras de tejido de gran tamaño.

Se tomaron muestras del lóbulo occipital humano de 3 donantes de cuerpos humanos (donante 1: hombre, 98 años; donante 2: mujer, 101 años; donante 3: mujer 90 años; sin enfermedades neuropatológicas conocidas, respectivamente) del programa de donación de cuerpos del Departamento. de Anatomía y Embriología, Universidad de Maastricht (UM). Se utilizó tejido de los donantes 2 y 3 para la evaluación de la contracción (Figura complementaria 3). Los donantes de tejidos habían dado su consentimiento informado y por escrito para la donación de su cuerpo con fines de enseñanza e investigación según lo regula la ley holandesa para el uso de restos humanos para la investigación y la educación científica (“Wet op de Lijkbezoringing”). En consecuencia, un codicilo escrito a mano y firmado por el donante posado cuando aún estaba vivo y sano se conserva en el Departamento de Anatomía y Embriología de la UM, Maastricht, Países Bajos. Los cerebros humanos se fijaron por primera vez in situ mediante perfusión corporal completa a través de la arteria femoral. Bajo una presión de 0,2 bar, el cuerpo fue perfundido con 10 l de líquido de fijación (1,8 % en volumen de formaldehído, 20 % de etanol, 8,4 % de glicerina en agua) en 1,5 a 2 h. Posteriormente el cuerpo fue preservado durante al menos 4 semanas para su posterior fijación, sumergido en el mismo líquido. Posteriormente, se recuperaron muestras de cerebro mediante disección de la calvaria y se almacenaron en paraformaldehído al 4 % en solución salina tamponada con fosfato (PBS) 0,1 M durante 14 a 30 meses.

Todas las muestras de resección de próstata se recuperaron del archivo del Departamento de Patología del Centro Médico de la Universidad de Maastricht (MUMC+) en el período comprendido entre 2007 y 2015. Para esta publicación, se utilizaron tres muestras. Este estudio fue aprobado por el Comité de Revisión de Ética Médica del Centro Médico de la Universidad de Maastricht en los Países Bajos (2020-1537). Todas las muestras fueron recolectadas y estudiadas de acuerdo con el protocolo del Código de conducta holandés para la investigación observacional con datos y tejidos personales (2004)29. Las muestras fueron recibidas con fines de diagnóstico y procesadas de acuerdo con los procedimientos operativos estándar internos de acuerdo con las recomendaciones nacionales e internacionales. El espesor de la sección axial de montaje completo de la muestra de próstata oscila entre 3 y 5 mm. En resumen, las muestras se fijaron inicialmente con formalina tamponada al 4% durante 24 h y se procesaron posteriormente en el procesador de infiltración al vacío Tissue Tek VIP6 (Sakura Finetek USA, Inc, Torrance, CA, EE. UU.), donde las muestras se deshidrataron sumergiéndolas en una serie de soluciones de etanol de concentración creciente hasta alcanzar alcohol puro y exento de agua. Este paso fue seguido por una limpieza del tejido en una solución de xileno, con la consiguiente infiltración de la muestra en parafina. Finalmente, las muestras se incluyeron en parafina de acuerdo con los procedimientos de diagnóstico patológico de rutina en el Centro de incrustación HistoCore Arcadia (Leica Microsystems BV, Ámsterdam, Países Bajos).

Todas las muestras se aclararon y etiquetaron con rojo neutro utilizando el protocolo MASH-NR como se describe en nuestra publicación anterior19. Dado que el protocolo clínico estándar de próstata produjo muestras fijadas con formalina e incluidas en parafina (FFPE), se utilizó un protocolo MASH modificado (FFPE-MASH-NR) para procesar muestras de próstata FFPE. En el protocolo FFPE-MASH-NR, las muestras de próstata debían desparafinarse antes de la limpieza estándar de MASH. Para ello, las muestras se incubaron durante 3 a 7 días en xileno dependiendo del tamaño de la muestra (para cada muestra se utilizó un volumen de xileno de aproximadamente 200 ml). Los bloques de parafina se recortaron manualmente tanto como fue posible antes de la incubación. Después de eso, las muestras se rehidrataron durante 1 h cada una en 100 ml de xileno, 2 x 100%, 70%, 50% de etanol (EtOH) y finalmente PBS. Las muestras rehidratadas se mantuvieron en una solución tamponada de PFA al 4% hasta su uso. La limpieza y el etiquetado de las muestras con FFPE-MASH siguieron los mismos pasos que se describen a continuación para las muestras de cerebro. Durante todos estos pasos, las muestras de próstata se guardaron en recipientes de vidrio individuales y se incubaron en al menos 50 ml de la solución respectiva. Los contenedores se mantuvieron en una coctelera en todo momento.

Todas las muestras se aclararon y etiquetaron con rojo neutro utilizando el protocolo MASH-NR como se describe en nuestra publicación anterior19. En resumen, las muestras se deshidrataron durante 1 h cada una en una mezcla acuosa (v/v) de 20, 40, 60, 80 y 100 % de metanol (MeOH) a temperatura ambiente (RT) y 1 h en 100 % MeOH a 4 °C. Después de eso, las muestras se blanquearon durante la noche en una solución fría recién preparada de H2O2 al 5 % en MeOH a 4 °C. Luego, las muestras se rehidrataron durante 1 h cada una en MeOH al 80 %, 60 %, 40 %, 20 % y se permeabilizaron en solución salina tamponada con fosfato + Triton X-100 al 0,2 % (v/v), pH 7,4. A esto le siguió una incubación de 1 h en solución acuosa recién filtrada de disulfito de potasio al 50 % (p/v) y 5 enjuagues rápidos seguidos de 1 h de lavado en agua destilada. El etiquetado para citoarquitectura se realizó durante 5 días en una solución de rojo neutro al 0,001 % en tampón citrato-fosfato (también conocido como tampón McIlvain) a pH 4. Las muestras se voltearon después de la mitad del tiempo de incubación. Después del etiquetado, las muestras se lavaron 2 x 1 h en tampón McIlvain a pH 4 y se deshidrataron durante 1 h cada una en MeOH al 20 %, 40 %, 60 %, 80 %, 2 x 100 %. La deslipidación se realizó durante la noche en 66 % de diclorometano (DCM)/33 % de MeOH, seguido de 2 x 1 h con 100 % de DCM. Finalmente, las muestras se incubaron con cinamato de etilo (ECi) como solución de adaptación del índice de refracción (RIMS). Todos los pasos se llevaron a cabo a temperatura ambiente.

Para la incubación de múltiples cortes coronales de lóbulos occipitales completos se utilizó un frasco de vidrio de 8 cm de diámetro, con espaciadores de polietileno o politetrafluoretileno, con el fin de brindar compatibilidad con los solventes orgánicos utilizados durante la deslipidación. Para evitar que los espaciadores de plástico dejen impresiones en el tejido, se colocaron trozos de papel de filtro encima y debajo del tejido. El frasco de vidrio se llenó completamente para cada paso descrito anteriormente (un volumen de aproximadamente 200 ml) y las soluciones se agitaron constantemente con un agitador magnético durante todo el procesamiento.

Para evaluar la contracción del tejido inducida por MASH, medimos el área de superficie de un total de 13 cortes de cerebro de tres donantes diferentes (muestra "Occlobe16" n = 4, tejido del mismo donante como se muestra en las figuras 3-7; muestra “Occlob10” n = 6; muestra “Hemi6” n = 3, cortes coronales anteriores al lóbulo occipital). Se tomaron cortes “Occlobe10” (n = 6) de otro lóbulo del que se tomaron imágenes para un proyecto independiente. Se tomaron cortes "Hemi6" (n = 3) de material preseccionado proporcionado por el Departamento de Anatomía y Embriología de la Universidad de Maastricht. Estas secciones coronales del cerebro cortadas manualmente de aprox. Se cortaron además 1 cm de espesor en muestras de 5 mm de espesor, antes del procesamiento MASH. Se tomaron imágenes digitales escaladas antes de la limpieza y al final del procedimiento de limpieza, después de la comparación de RI. La circunferencia de los cortes de tejido se segmentó manualmente en FIJI y se midió el área antes y después de la limpieza (Figura complementaria 3).

Para las imágenes ct-dSPIM, se imprimieron en 3D grandes cámaras de imágenes personalizadas (20 × 15 × 3 cm, volumen de aproximadamente 900 ml) (Fig. 8) en material de cuenca resistente a ECi (Somos®WaterShed XC 11122) o polipropileno (PP ). La impresión fue realizada por SKM Rapid Modeling bv (Helmond, Países Bajos) mediante estereolitografía (SLA) para las impresiones de cuencas o producida mediante sinterización láser selectiva (SLS) por Materialize NV (Lovaina, Bélgica) para las cámaras de PP. El área de imágenes de las cámaras se equipó con un portaobjetos de vidrio de 178 × 127 × 1,2 mm (Ted Pella Inc., Redding, EE. UU.) como fondo para disminuir los reflejos de la luz y se pegó con sellador de silicona pura. Todas las muestras se pegaron al portaobjetos de vidrio en la cámara de imágenes impresa en 3D con pegamento caliente (Rapid AB, Hestra, Suecia). Luego, la cámara de imágenes se llenó con al menos 500 ml de solución ECi (RI 1,56) con cantidades mayores dependiendo del tamaño de la muestra.

El microscopio ct-dSPIM está destinado a obtener imágenes en 3D de muestras de tejido aclaradas muy grandes con un espesor de hasta 5 mm y un tamaño lateral limitado solo por el recorrido de la etapa XY y los límites de tiempo de obtención de imágenes. Se derivó del sistema diSPIM (microscopía de iluminación de plano selectivo invertido de doble vista)31 y se desarrolló conjuntamente con Applied Scientific Instrumentation Inc. (ASI, Eugene, EE. UU.). En la Fig. 9 se muestra un esquema óptico del sistema ct-dSPIM. La fuente de luz láser (Coherent obis, línea láser 552 nm LS 40 mW SISTEMA LÁSER: FIBRA PIGTAIL: FC) tiene una salida de fibra monomodo con un apertura (NA) de 0,12. La luz láser emitida se colima y pasa a través de una lente sintonizable electrónicamente (ETL) (C 60-TUNELENS-100, ASI) hacia el “escáner” de lámina de luz (MM-SCAN-1.2, ASI). La lente sintonizable permite controlar electrónicamente la posición axial de la cintura del haz en la muestra. El escáner contiene un espejo microelectromecánico 2D (MEMS) que barre el haz gaussiano a través de la muestra una vez por imagen de la cámara para formar una hoja de luz "virtual" o "digital". El otro eje del espejo MEMS se utiliza para ajustar el l coincidente con el plano focal del objetivo de detección. El haz de escaneo se transmite al plano focal posterior del objetivo de iluminación de inmersión múltiple (#54-10-12, Óptica especial/Instrumentación científica aplicada (ASI).

La fluorescencia se recoge mediante un objetivo de detección de inmersión múltiple idéntico (#54-10-12, Óptica especial/ASI) y da como resultado una resolución de ~1 μm lateralmente (dependiendo del RI de la solución de imágenes). Los objetivos son compatibles con un índice de refracción (RI) de 1,33 a 1,56 y una distancia de trabajo (WD) de 12 mm. Tanto la apertura numérica (NA) como la distancia focal efectiva (EFL) varían con el índice de refracción, pero para ECi la NA es ~0,43, la EFL es 11,2 mm y el aumento es 17,9×. La profundidad máxima de imagen es de 5 mm y está limitada por la distancia física de los dos objetivos. Los objetivos se mantienen mediante mecánicas que incluyen ajustes finos manuales para alinear los dos objetivos (SPIM-DUAL-K2, ASI).

Las rutas de excitación y detección se combinan en un espejo policroico (ZT488/543/635rpc-UF2, Chroma) y una rueda de filtros motorizada (FW) (FW-1000-8, ASI) con tres filtros de emisión (ET519/26 m; ET576 /31 m; ET655lp, Chroma), que permite imágenes en tres colores. En este trabajo, el objetivo era obtener imágenes eficientes de un solo color en volúmenes muy grandes y solo se utilizó la banda de color medio con un filtro de emisión ET576/31 m. La fluorescencia filtrada se enfoca en una cámara científica de semiconductores de óxido de metal complementario (sCMOS) de 2048 × 2048 píxeles (ORCA-Flash4.0 V3, Hamamatsu) mediante una lente de tubo (C60-TUBE-B, ASI; f = 200 mm). . La lente del tubo proporciona un muestreo Nyquist de 0,3625 μm/píxel con un RI de 1,56, con un campo de visión horizontal de 0,74 mm sobre los 2048 píxeles de la cámara.

Las tiras de imágenes se recolectan con una combinación de escaneo en etapa (es decir, la muestra se mueve a través de una hoja de luz estacionaria usando la etapa XY, Figura complementaria 4), mosaico lateral/vertical usando una etapa XY motorizada (MS-8000, escaneo optimizado ) y actuadores Z motorizados (Focusing Translation Platform (FTP-2050), ASI). La velocidad de adquisición es >108 vóxeles/seg con un tiempo de exposición de 10 ms. El firmware de escaneo en etapa emite un disparador TTL interno (tiempo de vida) que garantiza el posicionamiento inicial reproducible (<1 μm) de cada tira de imagen. Un controlador ASI Tiger (TG-1000) contiene componentes electrónicos de control para las etapas motorizadas, espejo MEMS, lentes sintonizables y disparadores de cámara y láser. Sincroniza todos estos elementos con precisión sub-ms durante cada tira de imagen según el activador de escaneo de la etapa inicial.

El microscopio está controlado por µManager 1.4.22, un software gratuito de control de microscopios de código abierto32. El complemento ASI diSPIM en µManager se utiliza tanto para alinear el microscopio como para configurar y realizar adquisiciones. El complemento de control de escenario se utiliza para realizar ajustes ETL estáticos en ambos ETL (V, izquierda; W, derecha).

Para algunas aplicaciones, la información 3D de una única vista o pila es suficiente. Sin embargo, para las imágenes de muestra grandes a las que nos referimos aquí, se utiliza un mosaico extensivo a lo largo de las adquisiciones de mosaicos yz, generalmente en combinación con pilas de imágenes largas escaneadas en la dirección x (Figura complementaria 4). Como sistema de visión dual, el ct-dSPIM tiene la ventaja adicional de que la función de los dos objetivos se puede invertir para recolectar otra pila desde una dirección perpendicular a expensas del doble del tiempo de obtención de imágenes. Sin embargo, dado que aquí el énfasis está en imágenes rápidas de gran volumen con resolución > 1 μm, en este trabajo no se emplea el modo de imágenes de vista dual.

Se tomaron imágenes de la muestra de tejido de próstata y cerebro humano marcada con MASH-NR con la línea láser de 552 nm a 1 mW (OBIS) y con un tiempo de exposición de 10 ms. Para ambas muestras, se realizó una exploración general de todos los cortes de tejido a escala de centímetros cúbicos con una resolución de muestreo isotrópico de 16,4 µm (que denominamos adquisición Mosaic 16). Además, para la muestra de cerebro humano, hemos realizado una exploración multiescala que consta de: (a) una exploración general Mosaic 16 de todo el corte de tejido, (b) una adquisición para un FoV seleccionado grande (~15 × 17 × 3 mm) con una resolución de muestreo isotrópica de 4,1 µm (denominada Mosaico 4) y (c) una adquisición para un FoV más pequeño (~5 × 10 × 3 mm) con alta resolución (0,725 µm × 0,5127 µm × 0,5127 µm) para una región de interés específica ( denominado Mosaico 0.5). La velocidad de la imagen es diferente dependiendo de qué imagen Mosaic se implemente. Para escaneos rápidos de descripción general de Mosaic 16, la velocidad de obtención de imágenes es de 1,7 h/1 cm3 y para escaneos ROI Mosaic 4 y Mosaic 0,5 de mayor resolución, la velocidad de obtención de imágenes es de 5 h/1 cm3 y 15,8 h/1 cm3, respectivamente (Tabla 2).

Mientras que los escaneos Mosaic 16 proporcionan conjuntos de datos 3D de un bloque de tejido completo con una resolución de muestreo mesoscópico isotrópico de 16,4 µm, Mosaic 4 y Mosaic 0.5 muestran regiones de interés con una resolución de muestreo isotrópico de 4,1 µm y casi 1 µm, respectivamente. Los pasos de corte en el momento de la adquisición son 11,60 µm para el Mosaico 16 y 2,90 µm para el Mosaico 4, lo que conduce a resoluciones de muestreo isotrópicas después de la corrección debido al escalado √2 (Figura complementaria 4). Los conjuntos de datos sin procesar se redujeron aún más de la siguiente manera: para Mosaic 16, 16 × en el plano (32 × 45 píxeles) y para Mosaic 4, 4 × (128 × 186 píxeles), para igualar el tamaño de paso del microscopio y producir una imagen isotrópica. conjunto de datos de 16,4 µm (Mosaico 16) o 4,1 µm (Mosaico 4) isotrópico después de enderezar. Para Mosaic 0.5, el paso de corte fue de 0,363 µm y se realizó una reducción de resolución en el plano de 2 × 2. Con estos parámetros, los escaneos de Mosaic 16 se adquieren a la velocidad más alta posible, limitados únicamente por la velocidad máxima de escaneo de la etapa. Los escaneos de Mosaic 4 se adquieren cerca de un muestreo de Nyquist de la resolución óptica axial de ~8 µm (es decir, espesor teórico de la lámina de luz), y los escaneos de Mosiac 0.5 se adquieren cerca de un muestreo de Nyquist de la resolución óptica en el plano lateral de ~1 µm. resolución. Al adquirir volúmenes de imágenes con ct-dSPIM, que utiliza escaneo en etapa para mover la muestra a través del plano de la imagen (es decir, la hoja de luz), los ejes no corresponden a las coordenadas ortogonales XYZ. En cambio, el eje Z de la cámara está en un ángulo de 45° hacia la dirección de escaneo del escenario (Figura complementaria 4). Por lo tanto, la adquisición de imágenes escaneadas en etapa conduce a una forma de pila paralelepipédica sesgada con ejes no ortogonales, que se deformarán cuando se vean en el sistema de ejes ortogonales. Una operación de enderezamiento transforma la pila paralelepipédica sesgada en una pila rectangular con los ejes ortogonales tradicionales (Figura complementaria 1b). El etiquetado de eje utilizado en las figuras de este trabajo es el etiquetado del eje del visor de imágenes con el eje x a lo largo del espesor de 3 a 5 mm del tejido y el eje z a lo largo de la dirección de escaneo de las pilas de imágenes (Figura complementaria 4c).

La reducción de muestreo se realiza escalando las imágenes al tamaño de píxel final con la función de escala en Fiji33. La reducción de muestreo redujo el tamaño del conjunto de datos a ~3–4 GB para una exploración Mosaic 16 de un corte completo del lóbulo occipital. Estos datos muestreados se procesaron posteriormente con el complemento FIJI BigSticher34. Primero, los datos se desviaron usando la opción “(des)desviación” y luego se unieron mediante la opción Correlación de fase, sin realizar más muestreos descendentes. Luego, los datos unidos se volvieron a guardar como un archivo tif de 16 bits. En algunos casos, para la visualización, el conjunto de datos fusionados isotrópicos finales se cortó en FIJI a lo largo de la dirección YZ para proporcionar una vista coronal de las muestras. El tiempo total de muestreo para un escaneo de Mosaic 16 y Mosaic 4 toma 12 h en una estación de trabajo de PC con 32 RAM, CPU Intel(R) Xeon(R) E5-1650 v3 a 3,50 GHz y 10 HDD de almacenamiento. Además, para un Mosaic 0.5 no es necesario reducir el muestreo. El tiempo total de costura con el complemento BigStitcher es de aproximadamente 1 h para el escaneo Mosaic 16 y 2 h para el escaneo Mosaic 4, respectivamente. Para Mosaic 0.5 se necesitan aproximadamente 3 días de costura en BigStitcher.

La visualización 3D y el recuento de células de las pilas de volumen se realizaron con el software arivis Vision4D (versión 3.4.0). Para ello, se utilizó una única pila procedente de una adquisición Mosaic 0,5 en el área V2 del cerebro humano y que cubría todas las capas corticales. La pila enderezada, unida y rebanada se procesó con una canalización automatizada en Vision4D. Los datos sin procesar se filtraron primero con la opción de filtro de morfología y las células se segmentaron con el método de segmentación "buscador de blobs". Para derivar el número de células por capa, las capas corticales y la materia blanca se segmentaron manualmente con la herramienta de selección de polígonos en todo el volumen. La capa III se dividió en dos subcapas IIIa y IIIb según diferencias notables en densidad y tamaño celular (p. ej., grandes neuronas piramidales que aparecen en la capa IIIb). Luego se aplicó una segunda canalización para crear compartimentos basados ​​en las capas segmentadas manualmente, que incluían solo los objetos segmentados de la canalización de segmentación celular que estaban completamente contenidos dentro de los bordes del segmento de capa y tenían un tamaño superior a 125 µm3. Las características derivadas de estos segmentos compartimentados se extrajeron en tablas itemised.csv.

Para visualizar la resolución isotrópica de los conjuntos de datos Mosaic 16 y Mosaic 4 de menor resolución, se crearon vistas ortogonales en FIJI33 recortando los datos y creando MIP para cada eje. Los vídeos se crearon tanto con FIJI como con Vision4D. Las figuras fueron creadas con biorender (https://www.biorender.com).

Para validar el proceso de segmentación celular automatizada, se realizó un recuento celular manual en el mismo conjunto de datos. El volumen de datos se dividió en una cuadrícula de 100 × 100 µm, que se extendía por toda la profundidad de la pila, en el entorno Vision4D con un script de Python personalizado. Posteriormente, se seleccionaron pseudoaleatoriamente 10 planos y 5 ROI diferentes por plano utilizando la función "randi" en MATLAB (R2015b, MathWorks Inc.) como generador de números aleatorios. Las células se contaron manualmente dentro de cada ROI, considerando solo las células que estaban completamente contenidas dentro de los límites de la ROI o que se cruzaban con el borde izquierdo y/o inferior de la caja de 100 × 100 µm (Figura complementaria 3A). Se crearon gráficos de violín de la distribución de datos en MATLAB utilizando el script de Bechtold (2016; https://doi.org/10.5281/zenodo.4559847) para las celdas contadas manualmente, los resultados de segmentación del "buscador de blobs" sin filtrar, así como los resultados filtrados contienen solo segmentos mayores de 125 µm3 (“cuerpos celulares filtrados”; Figura complementaria 5b).

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen del informe de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Los datos de microscopía sin procesar se almacenan en un servidor de la facultad local. Los datos de origen numéricos para la validación del cerebro humano y las mediciones de contracción se muestran en los Datos complementarios 1 y 2. Todos los demás datos están disponibles del autor correspondiente a solicitud razonable.

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Agradecemos a Maurizio Abbate (Arivis AG) por proporcionarnos amablemente el script de Python personalizado para el entorno Vision4D para dividir el volumen de datos en una cuadrícula de 100 × 100 µm. Además, agradecemos al Dr. Jon Daniels (Applied Scientific Instrumentation) por su asesoramiento técnico y por proporcionarnos en la Fig. 9 el diseño óptico del ct-dSPIM. Este proyecto fue parcialmente financiado por la subvención Veni AES 2020 del programa de talentos de la fundación científica holandesa (NWO), que fue otorgada al Dr. Schueth (número de expediente: 18139). El Prof. Roebroeck recibió el apoyo de una subvención inicial del ERC (MULTICONNECT, n.° 639938) y de la subvención VIDI de la fundación científica holandesa (NWO) (n.° 14637).

Estos autores contribuyeron igualmente: Anna Schueth, Sven Hildebrand.

Departamento de Neurociencia Cognitiva, Facultad de Psicología y Neurociencia, Universidad de Maastricht (UM), Maastricht, Países Bajos

Anna Schueth, Sven Hildebrand, Shubharthi Sengupta, Annemarie Kiessling, Michael Capalbo y Alard Roebroeck

Departamento de Patología, Centro Médico de la Universidad de Maastricht (MUMC+), Maastricht, Países Bajos

Iryna Samarska y Axel zur Hausen

Departamento de Anatomía, Universidad de Maastricht (UM), Maastricht, Países Bajos

Andreas Herrler

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AS realizó todos los experimentos de microscopía de lámina de luz, ejecutó el microscopio ct-dSPIM con mantenimiento y trabajó en el desarrollo conjunto del prototipo (junto con Applied Scientific Instrumentation, ASI, Eugen, Oregon, EE. UU.); SH realizó la preparación de la muestra, la limpieza óptica y desarrolló el protocolo FFPE-MASH; SH y AS hicieron las cifras y análisis; SS brindó asistencia con la impresión 3D de las cámaras de imágenes; AK proporcionó asistencia de laboratorio (limpieza óptica y adquisición de imágenes); AH proporcionó el tejido cerebral humano y su experiencia en anatomía humana; IS y AzH fueron los patólogos en este proyecto y proporcionaron material sobre el cáncer de próstata, experiencia en el cáncer de próstata y calificaron el puntaje de Gleason del material del paciente; AR diseñó el estudio, codesarrolló el prototipo del microscopio ct-dSPIM y realizó la supervisión; MC hizo la cosupervisión; AS, SH, AR y MC escribieron el artículo. Todos los autores leyeron, comentaron y/o editaron el artículo.

Correspondencia a Anna Schueth o Alard Roebroeck.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Communications Biology agradece a Ludovico Silvestri y a los demás revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Editores principales: Chao Zhou y Karli Montague-Cardoso.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

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Reimpresiones y permisos

Schueth, A., Hildebrand, S., Samarska, I. et al. Imágenes eficientes de láminas de luz en 3D de muestras de tejido de próstata y cerebro humano aclaradas ópticamente a muy gran escala. Común Biol 6, 170 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-04536-4

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Recibido: 26 de julio de 2022

Aceptado: 26 de enero de 2023

Publicado: 13 de febrero de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-04536-4

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