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Naturaleza (2023)Cita este artículo

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La netrina-1 está regulada positivamente en los cánceres como mecanismo protumoral1. Aquí describimos la regulación positiva de netrina-1 en la mayoría de los carcinomas de endometrio (CE) humanos y demostramos que el bloqueo de netrina-1, utilizando un anticuerpo anti-netrina-1 (NP137), es eficaz en la reducción de la progresión tumoral en un modelo de ratón CE. A continuación, examinamos la eficacia de NP137, como agente único de primera clase, en un ensayo de fase I que incluyó a 14 pacientes con CE avanzada. Como mejor respuesta observamos 8 enfermedades estables (8 de 14, 57,1%) y 1 respuesta objetiva como RECIST v.1.1 (respuesta parcial, 1 de 14 (7,1%), reducción del 51,16% en las lesiones diana a las 6 semanas en adelante a una reducción del 54,65% durante los siguientes 6 meses). Para evaluar el mecanismo de acción de NP137, se realizó un perfil genético de tumores de ratón y observamos, además de la inducción de la muerte celular, que NP137 inhibía la transición epitelial a mesenquimatosa (EMT). Al realizar una secuenciación masiva de ARN (RNA-seq), transcriptómica espacial y RNA-seq unicelular en biopsias pareadas antes y durante el tratamiento de pacientes con EC del ensayo NP137, observamos una reducción neta en la EMT del tumor. Esto se asoció con cambios en el infiltrado inmunológico y mayores interacciones entre las células cancerosas y el microambiente del tumor. Dada la importancia de la EMT en la resistencia a los estándares de atención actuales2, mostramos en el modelo de ratón EC que una combinación de NP137 con carboplatino-paclitaxel superó al carboplatino-paclitaxel solo. Nuestros resultados identifican el bloqueo de netrina-1 como una estrategia clínica que desencadena tanto la reducción del tumor como la inhibición de la EMT, aliviando así potencialmente la resistencia a los tratamientos estándar.

Netrin-1 es una glicoproteína embrionaria secretada relacionada con la laminina que desempeña funciones clave en la navegación neuronal, la angiogénesis y la supervivencia celular1,3,4. Se ha demostrado que la netrina-1, que se expresa principalmente durante el desarrollo embrionario, es reexpresada tanto por las células cancerosas como por el microambiente tumoral en una gran proporción de neoplasias humanas1,5. Específicamente, se ha demostrado que esto ocurre en el cáncer colorrectal asociado a inflamación6,7, el cáncer de mama metastásico8, el cáncer de pulmón9, el neuroblastoma10, el linfoma11 y el melanoma12. En modelos preclínicos que imitan estas enfermedades, la interferencia entre netrina-1 y sus receptores fue suficiente para desencadenar la muerte de las células cancerosas e inducir la inhibición del crecimiento tumoral1,5,11,12. Sobre la base de estos hallazgos, se desarrolló un anticuerpo monoclonal (mAb) que neutraliza la netrina-1 y bloquea la interacción netrina-1-UNC5B, denominado NP137, y se sometió a una evaluación preliminar de seguridad y eficacia en pacientes con tumores sólidos avanzados en un ensayo de fase 1 (NCT02977195 ). Debido a algunas respuestas objetivas observadas en casos ginecológicos durante la fase de aumento de dosis, la fase de extensión del ensayo se enriqueció en pacientes portadoras de tumores endometriales. También se ha establecido una cohorte específica, con biopsias obligatorias antes y después del tratamiento, para la investigación traslacional. Los datos preliminares de este ensayo se divulgaron en la reunión de la ESMO de 201914, pero el ensayo aún está en curso, los pacientes continúan recibiendo tratamiento y los resultados se informarán en su totalidad después del análisis final. En este artículo informamos datos traslacionales generados en paralelo con el estudio de Fase 1 que incluye pacientes con cáncer de endometrio y proporcionamos una serie de datos preclínicos y de biopsias que demuestran que NP137 no solo reduce el número de células tumorales sino que también desencadena la inhibición de la transición epitelial a mesenquimatosa ( EMT), lo que en última instancia aumenta la sensibilidad del tumor a la quimioterapia.

Analizamos la expresión de netrina-1 mediante PCR cuantitativa con transcripción inversa (RT-qPCR) en una cohorte de 72 tumores de endometrio humanos (Tabla complementaria 1a). Como se muestra en los datos ampliados, figura 1a, la netrina-1 está significativamente regulada positivamente en el adenocarcinoma de endometrio (CE) sin cambios específicos en los grados o subtipos (datos ampliados, figuras 1b, c). También se encontró que su receptor principal, UNC5B, se expresa más en tejidos tumorales que en el endometrio normal (Datos ampliados, figuras 1a a c), mientras que DCC, otro receptor de netrina-1, no se expresa ni en el endometrio normal ni en el cáncer de endometrio. La positividad de Netrin-1 (y UNC5B) se controló en la mayoría de los tumores de endometrio mediante inmunohistoquímica (IHC) (Datos ampliados, figura 1d).

Por lo tanto, pasamos a un modelo preclínico que recapitula el desarrollo de EC, utilizando el modelo de ratón con eliminación de Pten f/f controlado temporalmente y diseñado genéticamente (es decir, el promotor CAG-CreERT+/− inducible por tamoxifeno), que se ha demostrado que desarrolla EC. in situ rápidamente, así como hiperplasia tiroidea15 (Fig. 1a). Por lo tanto, tratamos ratones de control y con eliminación de Pten durante 3 a 4 semanas con NP137 (10 mg kg–1, tres veces por semana) y analizamos la expresión de netrina-1 y la progresión del tumor. Como se muestra en la Fig. 1b, c, la netrina-1 aumentó en tumores de ratón después de la eliminación de Pten, y esta regulación positiva disminuyó después del tratamiento con NP137. De interés, NP137 se asoció con un menor desarrollo de tumores endometriales (Datos ampliados, Fig. 2a) y una mayor supervivencia (Fig. 1d; tenga en cuenta que no hubo extensión del estudio después de 7 semanas después de la eliminación de Pten porque la mayoría de los ratones mostraron dificultades respiratorias u otros dolencias debidas al desarrollo de tumores de tiroides). Los patólogos observaron una disminución del número de células cancerosas después del tratamiento con NP137 (Fig. 1e) y un tejido endometrial más saludable (Fig. 1f). De manera similar, también se observó actividad antitumoral en las tiroides de ratones tratados con NP137 (Datos ampliados, figuras 2b-e). Estos resultados indican que apuntar a netrina-1 en la CE inhibe la progresión tumoral.

a, Diagrama que muestra la estrategia experimental utilizada para inducir la eliminación de Pten en ratones CAG-CreERT2+/−Pten f/f usando inyección de tamoxifeno y tratamiento con NP137 o control. Los ratones fueron sacrificados si experimentaban dificultades respiratorias15. b, Expresión relativa del ARN mensajero de netrina-1 definida por RT-qPCR en el endometrio de animales CreERT2–/– (n = 12) y en tumores inducidos después de la eliminación de Pten (inyección de tamoxifeno) en ratones CreERT2+/− Pten f/f tratados por vía intraperitoneal con NP137 (10 mg kg–1) (n = 12) y en control (n = 5). Las barras son media ± sem; datos normalizados al gen HPRT; Cp, punto de cruce. ***P < 0,001 CreERT2+/– versus CreERT2–/– y #P = 0,0284 NP137 versus control mediante la prueba bilateral de Mann-Whitney. c, Análisis IHC representativo de netrina-1 de CE en ratón CreERT2+/− Pten f/f después de 6 semanas de inyección de tamoxifeno. Barra de escala, 100 µm. d, curvas de Kaplan-Meier que indican el porcentaje de supervivencia para ratones normales (CreERT2–/–, rojo, n = 8), ratones con eliminación de Pten tratados con NP137 (verde, n = 14) y control (azul, n = 11). **P < 0,01 según la prueba de Mantel-Cox. e, Cuantificación por patólogos de las lesiones endometriales, presentadas por la complejidad del tumor (color progresivamente más oscuro desde hiperplasia hasta neoplasia intraepitelial endometrial leve, luego moderada, hasta adenocarcinoma) entre ratones de control (n = 12) y aquellos tratados con mAb NP137 (n = 16) . ***P < 0,001 mediante la prueba de chi cuadrado y la prueba exacta bilateral de Fisher. f, Imágenes representativas de la tinción H&E del útero de ratones sacrificados en la semana 6 de la inyección de tamoxifeno, los tratados con NP137 y el control. Barra de escala, 50 µm.

Datos fuente

Sobre la base de resultados anteriores que sugieren que el bloqueo de netrina-1 es una estrategia terapéutica viable en el cáncer, se desarrolló un anticuerpo bloqueador de netrina-1 para uso clínico13 y se encuentra en fase de evaluación I/II. Extrajimos datos de eficacia de 14 pacientes con CE del estudio de fase 1 en curso (Tabla complementaria 1b,c). En este estudio, se administró NP137 una vez cada 2 semanas (Q2W) como monoterapia hasta la progresión clínica/radiológica. Como se muestra en la Fig. 2a y en la Tabla de datos ampliados 1a, no se observó toxicidad limitante de la dosis y más de la mitad de los pacientes (8 de 14) tuvieron control de la enfermedad (enfermedad estable) como mejor respuesta (mejor respuesta general, enfermedad estable, 57,1%). Además, una paciente de 74 años con CE avanzada tuvo una respuesta parcial definida por RECIST1.1 (paciente nº 02-004; Tabla complementaria 1b). El diagnóstico original de esta paciente mostró un origen endometrioide, un fenotipo microsatélite estable y expresión de CK7, PAX8 y receptores de estrógeno, pero ninguna expresión de CK20 o receptor de progesterona. Antes de la administración de NP137, había recibido múltiples intentos terapéuticos, incluida radioterapia adyuvante y carboplatino-paclitaxel seguido de lurbinectedina como tratamiento de primera línea para la enfermedad metastásica, y un segundo intento con carboplatino-paclitaxel, pero tuvo progresión de las metástasis hepáticas a pesar de estas terapias. Una tomografía por emisión de positrones-tomografía computarizada (PET-CT), realizada en el momento de la inclusión, confirmó una intensa captación de fluorodesoxiglucosa (antes de C1D1). Recibió 14 mg kg–1 de NP137 intravenoso cada dos semanas y se sometió a una exploración PET-CT a las 6 semanas (es decir, después del ciclo 3 de NP137), que mostró una respuesta parcial según RECIST v.1.1 con una reducción del 51 % en las lesiones hepáticas diana ( Fig. 2b, cy Tabla de datos ampliados 1b). La respuesta parcial se confirmó en la exploración PET-CT a los 3 meses (Fig. 2c) y luego nuevamente a los 6 meses, cuando la reducción del tamaño de las lesiones diana alcanzó el 55% (Tabla de datos ampliados 1b). Este paciente finalmente experimentó una progresión de la enfermedad después de 17 ciclos de NP137 y pasó a recibir terapia adicional, incluido letrozol A, inmunoterapia y tamoxifeno, sin experimentar una respuesta objetiva adicional.

a – c, Catorce pacientes (edad media, 68,3 años (44,7–80,6); estado funcional ECOG 0, n = 5; estado funcional ECOG 1, n = 9) que tenían EC en estadio IV avanzado o metastásico y fueron tratados previamente con un La mediana de tres (2,0–6,0) líneas de tratamiento sistémico antes de la inclusión fueron tratadas con NP137 (14 mg kg–1, n = 11 pacientes o 20 mg kg–1, n = 3 pacientes) con una mediana de 5,5 inyecciones (2,0–17,0 ). a, Cada barra representa un paciente. Las mejores respuestas al tratamiento se presentan según la revisión del investigador (según el protocolo). Estrellas rellenas, progresión radiológica según RECIST v.1.1; estrellas huecas, progresión clínica según evaluación del investigador; puntas de flecha rojas, respuesta parcial según RECIST v.1.1; puntas de flecha verdes, enfermedad estable según RECIST v.1.1; círculos rojos, muerte. b, Gráfico que presenta la evolución del tamaño de las lesiones diana (suma de dos lesiones diana del hígado) del paciente no. 02-004 tratado por vía intravenosa con 14 mg kg–1 NP137 cada 2 semanas. La respuesta tumoral se evaluó como respuesta parcial (RP) a las 6 semanas y luego a los 3, 6 y 9 meses; −30 % de reducción en el tamaño de las lesiones diana en comparación con el valor inicial indica una respuesta parcial según RECIST v.1.1. También se indica una línea de puntos que muestra el aumento del 20 % en el tamaño de las lesiones diana en comparación con el nadir (tamaño mínimo de las lesiones tras el tratamiento con NP137). c, Exploraciones transversales abdominales que presentan metástasis hepática al inicio del estudio, C3D1 (pos ciclo 3) y C6D1 (pos ciclo 6) del paciente n. 02-004. Las puntas de flecha rojas indican lesiones de interés.

Datos fuente

Para comprender mejor los mecanismos subyacentes que vinculan el bloqueo de netrina-1 con la inhibición del crecimiento tumoral, primero analizamos, basándose en el modo de acción hipotético del bloqueo de netrina-1, si la inhibición del crecimiento tumoral se asociaba con la muerte de las células tumorales en tumores Pten f/f. tratado con NP137. Como se muestra en la Fig. 3a, b, NP137 aumentó la apoptosis del cáncer medida por IHC en caspasa-3 activa. A continuación, realizamos una secuencia de ARN de tumores de ratón Pten f/f tratados con NP137 versus no tratados. Entre las vías/genes modulados después de la administración de NP137, notamos una disminución en los genes relacionados con EMT después del tratamiento. Varios estudios in vitro han sugerido la participación de netrina-1 en la EMT16,17,18,19, a menudo asociada con la vía PI3K/AKT, que frecuentemente está alterada en el cáncer de endometrio17,18. Luego investigamos si NP137 podría afectar la EMT tumoral en el modelo de ratón Pten f/f. Primero evaluamos la expresión del marcador epitelial EpCAM en los tumores control versus tratados con NP137, y observamos un aumento estadísticamente significativo de este marcador epitelial en los tumores tratados con NP137 (Fig. 3c, d). Para obtener una visión más general de la expresión de genes tumorales, utilizamos una firma EMT de cáncer de uso común20 que se puede emplear para determinar la puntuación EMT20. Observamos que el tratamiento con NP137 disminuyó la puntuación EMT (Fig. 3e), asociada con una disminución de la expresión de genes mesenquimales y una mayor expresión de genes epiteliales (Fig. 3f). Estos datos preclínicos respaldan la opinión de que el bloqueo de netrina-1 tiene una acción dual sobre las células tumorales: desencadenamiento de la muerte de las células cancerosas e inhibición de las características de la EMT, lo que hace que los tumores tratados con NP137 sean más epiteliales.

a, Cuantificación de la muerte celular utilizando IHC de caspasa-3 escindida en tumores control (n = 8) y tratados con NP137 (n = 13) de ratones CreERT2+/−Pten f/f. Las barras son media ± sem; *P = 0,0389 según la prueba bilateral de Mann-Whitney. b, Imágenes representativas de la tinción con caspasa-3 escindida de a. Barra de escala, 100 µm. c, Expresión relativa de ARNm del marcador epitelial EpCAM mediante RT-qPCR en tumores de ratón, control (n = 5) y NP137 (n = 9). Las barras son media ± sem, datos normalizados para el gen HPRT; *P = 0,032 según la prueba bilateral de Mann-Whitney. d, Porcentaje de células de alta expresión de EpCAM en tumores de control (n = 4) versus tratados con NP137 (n = 7) según lo evaluado por IHC. Las barras son media ± sem; **P = 0,0061 según la prueba bilateral de Mann-Whitney. e, análisis de puntuación EMT (ortólogos de ratón de firma epitelial (epit.) o mesenquimal (mes.) de la referencia 20) derivado de datos de secuencia de ARN, entre ratones tratados con control (n = 3) y NP137 (n = 3) . Las barras son media ± sem; *P = 0,05 según la prueba unilateral de Mann-Whitney. f, Mapa de calor derivado de datos de RNA-seq que muestran la expresión de genes EMT; control (n = 3) y NP137 (n = 3). Tenga en cuenta que los genes epiteliales estaban regulados positivamente en la condición tratada con NP137, mientras que los genes mesenquimales estaban regulados negativamente.

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A continuación, determinamos si la inhibición de las características de EMT observadas en los modelos preclínicos también ocurre en pacientes tratados con NP137. En el ensayo de fase 1 NP137, entre los pacientes con CE descrito anteriormente, se recogieron biopsias pareadas en el momento de la inclusión (C1D1) y después de 1 mes de tratamiento con el compuesto antinetrina-1 (es decir, justo antes de la tercera infusión de NP137 (C3D1). )). La secuenciación de ARN en masa se realizó con éxito en 12 biopsias pareadas antes y durante el tratamiento (Tabla complementaria 1b) y, como se muestra en la Fig. 4a, b, dos inyecciones de NP137 fueron suficientes para desencadenar una disminución significativa en la puntuación EMT del cáncer. descrito anteriormente, lo que indica un fenotipo general más epitelial del tumor en pacientes después de 1 mes de tratamiento con NP137. El cambio hacia un fenotipo más epitelial se confirmó mediante una mayor tinción con EpCAM IHC en muestras de tumores de pacientes tratados con NP137 (Fig. 4c, d). También observamos una disminución en la proporción de células tumorales que coexpresan pancitoqueratina y vimentina (Fig. 4e).

a, Diagrama que muestra la puntuación EMT calculada con la firma de Mak20 a partir de la secuencia de ARN de biopsias antes (C1D1) y después de dos ciclos de tratamiento con NP137 (C3D1) (n = 12). Los diagramas de caja representan la media (25.º a 75.º), los bigotes varían de valores mínimos a máximos y las muestras pareadas se identifican en una representación de un solo valor; *P = 0,0161 mediante prueba t bilateral. b, Gráficos de nadador que muestran la evolución individual de la puntuación EMT para cada paciente; ΔEMT es la puntuación de EMT en C3D1 menos la de C1D1; ΔEMT < 0 significa evolución hacia el fenotipo epitelial (verde) y >0 hacia el mesenquimatoso (rojo). c, Porcentaje de células de alta expresión de EpCAM en muestras de biopsia de C1D1 versus C3D1 identificadas por IHC; *P = 0,0313 mediante la prueba bilateral de Wilcoxon (n = 6 pacientes). Los diagramas de caja representan la media (25 a 75), los bigotes varían de valores mínimos a máximos y las muestras pareadas se identifican en una representación de un solo valor. d, IHC representativa de EpCAM en tumores en C1D1 y C3D1 para los pacientes núms. 01-030, 01-035 y 01-040. Barra de escala, 50 µm. e, Imágenes representativas de la expresión de pancitoqueratina (PanKRT) y vimentina (VIM) (colocalización de pancitoqueratina (verde) y vimentina (rojo) en la imagen fusionada, derecha) en adenocarcinoma de endometrio primario del paciente no. 01-040 antes y después del tratamiento con NP137. Barras de escala, 50 μm. Las cuantificaciones se realizaron en los portaobjetos completos y se observaron resultados similares para los pacientes nº. 01-030 y 01-034. f, Análisis del compartimento de células tumorales en los pacientes núms. 01-034 y 01-039 por expresión del gen espacial Visium. Gráfico de violín de la puntuación de enriquecimiento normalizado (NES) de EMT UCell a partir de una mancha de Visium tumoral seleccionada histológicamente entre las células de la biopsia C1D1 y C3D1. ***P < 0,01 según la prueba bilateral de Mann-Whitney.

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Es interesante señalar que al analizar los cambios en la puntuación EMT entre las biopsias iniciales y en tratamiento, observamos que las muestras de pacientes que tenían la progresión de la enfermedad como su mejor respuesta en NP137 (enfermedad progresiva en la primera evaluación a las 6 semanas) no mostraron variación en la puntuación EMT. Por el contrario, hubo una disminución estadísticamente significativa en la puntuación EMT en muestras de pacientes que tenían control de la enfermedad (al menos enfermedad estable a las 6 semanas; Datos ampliados, figura 3a).

Para demostrar más formalmente que el cambio masivo en la puntuación EMT observado con el tratamiento con NP137 en pacientes ocurría específicamente en células cancerosas, como primer enfoque utilizamos el sistema de expresión génica espacial Visium 10x compatible con tejidos fijados con formalina e incluidos en parafina (FFPE). . Se analizaron dos pares de secciones FFPE C1D1/C3D1 de dos pacientes con CE (Datos ampliados, Fig. 3b, c) y se realizó un perfil de expresión génica espacial en regiones de interés seleccionadas por patólogos donde solo las células cancerosas podían identificarse mediante hematoxilina y eosina ( tinción H&E). En ambos casos, la puntuación EMT disminuyó considerablemente en C3D1 en comparación con C1D1 (Fig. 4f). Por lo tanto, en los pacientes, después de 1 mes de tratamiento con NP137, las células cancerosas restantes mostraron características EMT disminuidas en comparación con su estado previo al tratamiento.

Para ampliar estos estudios al nivel unicelular, realizamos RNA-seq unicelular 3' (kit 10x Genomics Next GEM 3') directamente en biopsias frescas obtenidas en el momento de la inclusión (C1D1, 9216 células) en el ensayo NP137 y después de 1 mes. del tratamiento (C3D1, 7,159 células) de un paciente con CE avanzada (paciente n.° 01-040; Tabla complementaria 1b y Fig. 5a). La agrupación no supervisada mostró la presencia de diferentes poblaciones de células, incluidas células tumorales (que expresan EpCAM, PGR y TFF3, todos marcadores de EC21), células inmunes (marcadas por la expresión de CD45 (PTPRC)), fibroblastos asociados al cáncer (CAF, marcados por αSMA (ACTA2) )) y células endoteliales (PECAM1 positivas) (Fig. 5b y Datos ampliados Fig. 4a, b).

a, Ilustración del paciente no. 01-040 con dos biopsias de metástasis pulmonar: una antes del tratamiento (C1D1) y otra después de dos ciclos de tratamiento con NP137 (C3D1). b, Gráfico de proyección y aproximación múltiple uniforme (UMAP) de 16 375 células de dos biopsias de metástasis pulmonar (izquierda) o antes del tratamiento con 9216 células (C1D1, medio) y después del tratamiento con 7159 células (C3D1, derecha), coloreado según sus cuatro principales tipos de células. c, Composición de los principales tipos de células en biopsias de C1D1 y C3D1. Izquierda, número total de celdas en cada condición; derecha, proporción de células en cada muestra (tenga en cuenta que el número de células cancerosas disminuyó notablemente después del tratamiento). Codificación de colores como en b. d, Gráfico de violín de la puntuación de enriquecimiento de EMT UCell entre células de biopsia C1D1 y C3D1 (prueba de Wilcoxon bilateral, P <2,10-16). e, gráfico UMAP de células cancerosas subagrupadas de todo el conjunto de datos integrado (C1D1 + C3D1). f, gráfico UMAP de células cancerosas subagrupadas antes y después del tratamiento. g, Composición de grupos de células cancerosas en biopsias de C1D1 y C3D1. Izquierda, números de celular; derecha, proporción de células en cada muestra (tenga en cuenta que el número de células cancerosas disminuyó notablemente después del tratamiento). h, Gráfico de densidad de la puntuación de enriquecimiento de EMT UCell que muestra los grupos 2/3 con un fuerte enriquecimiento de EMT (tenga en cuenta que el grupo 2 disminuyó después del tratamiento (g, derecha)).

El tratamiento con NP137 condujo a una disminución estadísticamente significativa en el compartimento de células tumorales (Fig. 5b, cy Datos ampliados Fig. 4b). La proporción de células tumorales después del tratamiento con antinetrina-1 fue 3,19 veces menor después de dos ciclos de NP137 (Datos ampliados, figura 4b). Es interesante señalar que, además de la disminución neta de células cancerosas, observamos una disminución estadísticamente significativa en la puntuación EMT en todo el compartimento tumoral, lo que indica un fenotipo general más epitelial asociado con el tratamiento con NP137 (Fig. 5d). También realizamos análisis de vías y expresión diferencial imparcial solo en células tumorales (Tabla de datos ampliados 2). Sorprendentemente, EMT fue el término más significativo, con una regulación a la baja después de la exposición a NP137 (Tabla de datos ampliados 2). Es interesante que, después del tratamiento con NP137, la mayoría de los subcompartimentos de las células tumorales disminuyeron de manera similar y notamos que el grupo de tumores 2, que tuvo la disminución más fuerte, también mostró una puntuación EMT alta (Fig. 5e-h; tenga en cuenta que los grupos 5-7, con una puntuación EMT alta, no fueron detectables después del tratamiento con NP137, pero no podemos excluir la posibilidad de que no fueran capturados, porque estos grupos ya tenían muy pocas células en C1D1).

El cambio que ocurrió en el compartimento tumoral también se asoció con un cambio en las células estromales (Figs. 5b, cy 6 y Datos ampliados, Figs. 4c-f, 5 y 6a). Es de destacar que el tratamiento con NP137 claramente parecía tener un impacto en las células inmunes (Fig. 6a, by Datos ampliados Fig. 5a). Más específicamente, después del tratamiento con NP137, notamos un aumento en los linfocitos dotados de funciones citotóxicas (células T CD8 + y células asesinas naturales (NK); Fig. 6c y Datos ampliados Fig. 5b). También se observó un aumento similar en las células CD8+ en ratones Pten f/f tratados con NP137 (Datos ampliados, Fig. 5c, d). Es de interés que después del tratamiento con NP137 observamos tanto en el análisis unicelular del paciente no. 01-40 y en los datos transcriptómicos espaciales de los pacientes núms. 01-034 y 01-039 un aumento tanto en el número como en la fuerza de la interacción entre las células T y las células tumorales (Fig. 6d, e). En particular, los datos de secuencia de ARN unicelular mostraron un aumento en el número y la fuerza de las interacciones entre las células T CD8 + y las células tumorales (Fig. 6d). Se detectó una disminución en los macrófagos M2 (Datos ampliados, Fig. 5e, f), junto con un aumento en la presentación del antígeno de clase I/II de histocompatibilidad principal (Datos ampliados, Fig. 6a, b). El tratamiento con NP137 se asocia con células presentadoras de antígenos (APC) más eficientes porque observamos un cambio claro de monocitos en C1D1 a células dendríticas en C3D1 que interactúan con células cancerosas (Fig. 6d, ey Datos ampliados Fig. 6b).

a, gráficos UMAP de células inmunes subagrupadas de todo el conjunto de datos integrado (C1D1 + C3D1) para el paciente no. 01-040, que ilustra la composición de los principales grupos de células inmunitarias en biopsias de C1D1/C3D1 (izquierda) o por separado para C1D1 y C3D1 (derecha). b, Número (izquierda) y proporción (derecha) de tipos de células inmunitarias en cada muestra. c, izquierda, gráfico UMAP de linfocitos/células NK subagrupados de todo el conjunto de datos integrado (C1D1 y C3D1). Las células T reguladoras (Tregs) se determinaron de acuerdo con los marcadores que se muestran en la figura 5b de datos ampliados. En el centro, derecha, composición de los grupos de células T/NK en biopsias de C1D1 y C3D1; número de células (centro) y proporción de células en cada muestra (derecha). Tenga en cuenta que el número de células T CD8+ citotóxicas aumentó después del tratamiento, mientras que el de células CD4+ disminuyó. d, análisis CellChat del ensayo unicelular en el paciente no. 01-040, que muestra el número diferencial (C3D1/C1D1) de interacciones (izquierda) y la fuerza de las interacciones (derecha) entre células tumorales y linfocitos (arriba) y entre células tumorales y APC (abajo). e, análisis CellChat del ensayo Visium en los pacientes núms. 01-034 (arriba) y 01-039 (abajo), que muestran el número diferencial (C3D1/C1D1) de interacciones (izquierda) y la fuerza de las interacciones (derecha) entre células tumorales y células estromales. Los colores de las líneas indican números más altos o interacciones de fuerza en C3D1 (rojo) y C1D1 (azul). El tamaño del segmento es proporcional a la diferencia en el número o la fuerza de las interacciones entre C3D1 y C1D1.

Debido a una gran cantidad de literatura que describe la EMT como una de las principales causas de resistencia a la quimioterapia2,22 y debido a que nuestros datos sugieren que la acción dirigida a netrina-1 inhibe la EMT, evaluamos si la adición de NP137 al carboplatino-paclitaxel (carbotaxol), el estándar- La quimioterapia sin cuidados utilizada en entornos clínicos en el cáncer de endometrio podría mejorar la eficacia del carbotaxol solo en el modelo de adenocarcinoma de endometrio en ratones Pten f/f. Como se muestra en la figura 7 de datos ampliados, el tratamiento con NP137/carbotaxol demostró ser superior al carbotaxol solo, lo que condujo a respuestas completas en ratones. En conjunto, estos datos preclínicos y clínicos demuestran que un fármaco en etapa clínica induce la reducción de células tumorales y desencadena una inhibición general de las características de la EMT, lo que ofrece la posibilidad de aliviar la resistencia a las terapias convencionales.

Aquí proporcionamos documentación de la actividad clínica de la titulación de netrina-1 utilizando NP137 como monoterapia. Si bien el interés en atacar la netrina-1 en el campo del cáncer es relativamente reciente13, este informe indica que atacar la netrina-1 en el cáncer de endometrio puede ser eficaz. Además de la generación de una serie de datos, incluido el análisis de una cohorte humana y experimentos preclínicos en ratones, hemos confirmado un papel mecánico clave de la netrina-1 en la resistencia y progresión del cáncer de endometrio. También informamos una respuesta parcial detectada en un paciente con EC que recibió un mAb antinetrina-1. Esta respuesta parcial en un paciente humano, junto con la disminución en el recuento de células tumorales en ratones y la marcada disminución en las células tumorales observadas en el análisis de secuencia de ARN unicelular de un paciente tratado con NP137, respaldan aún más la visión inicial del modo de acción de el mAb netrina-1 como inductor de la muerte de células tumorales1,23. De hecho, anteriormente se consideraba que la netrina-1 era una molécula secretada embrionaria reexpresada en entornos de cáncer para promover la supervivencia de las células tumorales1,8. Se teoriza que NP137, al bloquear la netrina-1, desencadena la actividad pro-muerte del receptor de netrina-1, como se observa en varios modelos preclínicos11,12,13,24. En pacientes con CE o modelos preclínicos de CE tratados con NP137, se espera que esto se traduzca en una disminución de las células tumorales.

Sin embargo, aquí hemos demostrado que NP137 no solo induce la muerte de las células tumorales, sino que también parece afectar la EMT del tumor. Sólo unos pocos estudios previos han sugerido que la netrina-1 puede estar implicada en la EMT, y estos solo mostraron datos in vitro16,17,18,19, por lo que solo respaldan débilmente un efecto regulador importante de la netrina-1 en la EMT25. La EMT tumoral, en la que las células tumorales pierden sus características epiteliales y adquieren características mesenquimales, parece ser un factor clave de la heterogeneidad tumoral y se ha asociado con diferentes pasos en la tumorigénesis, como el inicio, la progresión, la metástasis y, más recientemente, la resistencia a la quimioterapia. o inmunoterapia2. Si bien se han logrado grandes avances en la comprensión del papel y los mecanismos por los cuales la EMT regula estas diferentes funciones tumorales, todavía no existe prácticamente ninguna intervención farmacológica que permita al médico aliviar la EMT en los tumores. También es justo decir que, hasta la fecha, debido a que no existen fármacos en etapa clínica que afecten únicamente a las características de la EMT, no hay ninguna demostración clínica de que la EMT sea clínicamente importante. Aquí demostramos, utilizando modelos preclínicos y biopsias previas y durante el tratamiento de pacientes con CE, que el tratamiento sistémico con NP137 condujo a una disminución en las características de la EMT del tumor. Esta inhibición de las características de la EMT se asocia con un fenotipo general más epitelial. Dada la extrema complejidad de la heterogeneidad tumoral, aún no hemos demostrado si el efecto de N137 en la EMT tumoral está mediado por un efecto directo del bloqueo de netrina-1 en las células cancerosas o si este efecto se debe a un efecto indirecto desencadenado por cambios en la Microambiente tumoral. Es probable que estos efectos estén combinados, porque hemos demostrado mediante análisis unicelular que los cambios en las características de la EMT están asociados con cambios en el microambiente del tumor. Aunque se requiere mayor confirmación, observamos una disminución en los fibroblastos asociados al cáncer, que generalmente sirven como fuente primaria de moléculas inductoras de EMT26, y una disminución en los macrófagos protumorales similares a M2, que también contribuyen a la EMT por múltiples mecanismos27. Además, observamos un aumento en los linfocitos dotados de funciones citotóxicas y un aumento tanto en el número como en la fuerza de las interacciones entre las células inmunes y las células tumorales asociadas con APC más eficientes. En conjunto, esto respalda la opinión de que NP137, posiblemente al afectar la EMT, mejora la respuesta inmune tumoral. Cualquiera que sea el mecanismo, debido a que cada vez hay más literatura que describe a la EMT como un actor importante en la resistencia a la quimioterapia y a los inhibidores de puntos de control inmunológico2,28, la observación de que el tratamiento con NP137 inhibe las características de la EMT tumoral aboga por la evaluación clínica de combinaciones de la antinetrina. -1 mAb con terapias convencionales para interferir con la progresión tumoral. Esto se investiga actualmente en el ensayo de fase 2 GYNET (NCT04652076) que evalúa la seguridad y eficacia de la combinación de NP137 con carboplatino-paclitaxel y/o pembrolizumab (mAb anti-PD1) en pacientes con cáncer de endometrio o cuello uterino.

Se obtuvieron ratones Pten homocigotos floxados (C;129S4-Ptentm1Hwu/J, en adelante denominado Pten f/f) Cre:ER (B6.Cg-Tg(CAG-CRE/Esr1* 5Amc/J) del Laboratorio Jackson. Cre:ER+ /- Se criaron ratones Pten f/f en un entorno mixto (C57BL6; 129S4) cruzando ratones Pten f/f y Cre:ER+/-. Para obtener ratones portadores de ambos alelos Pten floxed (Pten f/f) y un solo Cre :ER (Cre:ER+/-), Cre:ER+/- Se retrocruzaron ratones Pten f/+ con ratones Pten f/f. Para inducir la eliminación de los alelos floxados, se disolvió tamoxifeno (Sigma-Aldrich) en etanol al 100 % a 100 mg ml-1. La solución de tamoxifeno se emulsionó en aceite de maíz (Sigma-Aldrich) a 10 mg ml-1 mediante agitación. Para inducir la eliminación de Pten, se administró a ratones adultos (de 4 a 5 semanas de edad) una única inyección intraperitoneal de 0,5 mg de emulsión de tamoxifeno (30–35 μg mg–1 de peso corporal). Tres semanas después de la inyección de tamoxifeno, los ratones fueron tratados mediante inyección intraperitoneal de 100 µl de NP137, o su control isotípico NP001 diluido en PBS, a 10 mg kg–1 cada 2 días. El cuidado y alojamiento de los animales se realizaron de acuerdo con las directrices institucionales europeas del comité ético local CEEA de la Universidad de Lleida relativas a los experimentos con ratones Pten. Se controló el comportamiento general y el peso tres veces por semana y se sacrificaron los animales en caso de alteración fuerte o pérdida de peso inferior al 20%. Todos los ratones siempre fueron sacrificados antes de la progresión del tumor terminal, y un patólogo analizó los tejidos endometriales a ciegas.

Las muestras de endometrio recogidas en el Instituto de Investigación Biomédica de Lérida (España) se congelaron y se enviaron al Centro de Investigación del Cáncer de Lyon (Francia) en hielo seco. Las muestras se criomolieron para obtener polvo tumoral, que se procesó para la extracción de ARN total utilizando el kit Nucleospin RNA Plus (Machery-Nagel) según las instrucciones del fabricante. La expresión de ARNm se midió utilizando un NanoDrop1000 (Themo Scientific). El ARN se retrotranscribió utilizando el termociclador T100 (Bio-Rad) y el kit de síntesis de ADNc iScript (Bio-Rad) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La RT-qPCR se realizó utilizando LC480 qPCR (Roche) y OneGreen Fast qPCR Premix (Ozyme) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Análisis del paciente: el ARN de la microbiopsia del paciente se extrajo con el kit RNA easy FFPE (Qiagen). La biblioteca RNA-seq se produjo a partir de 100 ng de ARN con el kit Illumina TruSeq Exome (RNA Library Prep for Enrichment & TruSeq RNA Enrichment) según las instrucciones del fabricante y luego se secuenció con un Illumina NovaSeq 6000. Luego, los archivos FASTQ se procesaron con STAR (v.2.7.10a). Brevemente, los archivos FASTQ se asignaron al genoma de referencia humano (gencode.v.27) y las lecturas alineadas se convirtieron para contarlas con STAR. FATSQC (v.0.11.9) también verificó la calidad de los archivos FASTQ. El análisis de RNA-seq se realizó con R (v.4.0.3) y el paquete DESeq2 (v.1.30.1). Se calcularon las transcripciones transformadas log2 por millón y realizamos el cálculo de la puntuación EMT como se describió anteriormente20.

Modelo de cáncer de endometrio murino: se recogieron tumores, se congelaron instantáneamente y se criaron. El ARN se extrajo con un kit estándar (Macherey-Nagel). La biblioteca RNA-seq se produjo a partir de ARN con Illumina TruSeq Stranded Total RNA Library Prep Human/Mouse/Rat, según las instrucciones del fabricante, y luego se secuenció con Illumina NOVASeq. Los archivos FASTQ se procesaron como se describe anteriormente, excepto el genoma de referencia que era Mus_musculus.GRCm38 (versión GENECODE 25). El análisis se realizó con los paquetes DESeq2 (v.1.30.1) y ggplot (v.3.1.3) en R (v.4.0.3). La puntuación EMT y los mapas de calor se realizaron con fragmentos log2 por kilobase de exón por millón de valores de lecturas mapeadas.

Las biopsias de metástasis endometriales se disociaron para la secuenciación de ARN unicelular utilizando el kit de disociación de tumores de Miltenyi Biotec (n.º 130–095-929). Brevemente, la biopsia se colocó en medio RPMI en una placa de Petri sobre hielo y se cortó en trozos pequeños (2 a 4 mm) después de eliminar el tejido necrótico. Luego, las piezas se infundieron con la mezcla de RPMI/enzima (Miltenyi Biotec), se transfirieron a un tubo gentleMACS C que contenía la mezcla de RPMI/enzima, se conectaron a la manga del gentleMACS Octo Disociator y se ejecutaron usando el programa 37_h-TDK1. Después de completar el programa, las células se centrifugaron a 300 g durante 7 minutos a 4 °C, se resuspendieron en RPMI, se pasaron a través de un colador de 70 µm y se repitió la centrifugación. El sedimento celular se trató con 500 µl de solución ACK durante 5 minutos a temperatura ambiente y luego se detuvo la lisis con 5 ml de RPMI/FBS al 10%. Después de la centrifugación, las células se resuspendieron en 100 µl de RPMI. El número de células vivas se determinó con un contador de células de fluorescencia dual Luna-FL (Logos Biosystems) para obtener una población de recuperación celular esperada de 10.000 células por canal, cargadas en un chip 10x G y ejecutadas en el sistema Chromium Controller (10x Genomics). según las instrucciones del fabricante. Se generaron bibliotecas de RNA-seq unicelulares con el kit Chromium Single Cell 3' v.3.1 (10x Genomics, n.º PN-1000121) y se secuenciaron en la plataforma NovaSeq 6000 (Illumina) para obtener alrededor de 50 000 lecturas por célula.

Excepto cuando se mencione específicamente, todos los análisis se realizaron con los paquetes R/Bioconductor, R v.4.2.2 (2022-11-10 r83330) (https://cran.r-project.org/; http://www.bioconductor .org/) en un entorno Linux (x86_64-pc-linux-gnu (64 bits)).

Las matrices con códigos de barras filtradas a partir de datos de RNA-seq de una sola célula se importaron a R utilizando el paquete Seurat (v.4.1.1). Los dobletes se detectaron con DoubletFinder (v.2.0.3) y se filtraron, junto con las células que mostraban un número bajo de características (nFeature_RNA <500) o un alto porcentaje de genes mitocondriales (por encima del 25%). Se utilizaron funciones de Seurat para normalización (SCTransform), fusión, reducción dimensional y agrupación. La identificación inicial del tipo de célula se basó en el consenso de varios paquetes automatizados de anotación de células (SciBet' v.1.0, SingleR v.1.10.0 y scType (https://github.com/IanevskiAleksandr/sc-type/blob/master/README. Maryland)). Los subtipos de células T se inspeccionaron visualmente y se curaron manualmente después de realizar anotaciones adicionales con ProjecTILs (v.3.0.3) y la implementación en Python de CellTypist (v.1.3.0). Las puntuaciones de las firmas de EMT se calcularon mediante tres métodos (función AddModuleScore de Seurat, UCell (v.2.2.0) y AUCell (v.1.18.1)) y utilizando dos listas de genes diferentes (la vía MsigDb Hallmark EMT y la firma PanCancer EMT20). Los análisis de enriquecimiento de vías se realizaron con el paquete 'escape' (v.1.6.0). Las visualizaciones adicionales se basaron en funciones de Nebulosa (v.1.6.0), Scillus (v.0.5.0) y ggplot2 (v.3.3.6).

Las matrices e imágenes espaciales de RNA-seq se importaron a R utilizando la función Load10X_Spatial del paquete Seurat. Para cada muestra, solo aquellos puntos con más de 1000 características se mantuvieron para el preprocesamiento posterior, incluida la normalización SCTransform, la reducción dimensional y la agrupación. La mayoría de los análisis se realizaron de forma independiente para cada muestra (sin fusión ni integración). Se utilizaron dos estrategias para la anotación del tipo de célula: transferencia de etiquetas después de la integración de los datos de secuencia de ARN unicelular descritos anteriormente, y anotación manual utilizando marcadores conocidos para los principales tipos de células.

La inferencia de la comunicación entre células se realizó con CellChat (v.1.6.0), tanto para datos de secuencia de ARN unicelulares como espaciales.

Se sacrificaron ratones Cre:ER+/− Pten f/f mediante dislocación cervical después de 3 semanas de tratamiento con NP137. Se recogieron muestras de endometrio y se fijaron con formalina durante la noche a 4 °C. Los tumores se incluyeron en parafina para su posterior análisis histológico. Los bloques de parafina se seccionaron a 3 µm y se secaron durante 1 h a 65 °C antes de los procedimientos de pretratamiento de desparafinización, rehidratación y recuperación de epítopos en el módulo de pretratamiento a 95 °C durante 20 min en tampón Tris/EDTA 50X. Antes de teñir las secciones, se bloqueó la peroxidasa endógena. Se tomaron imágenes representativas con un microscopio Leica DMD108.

La inmunohistoquímica se realizó en un inmunotinción automatizado (Ventana discoverXT, Roche) utilizando el kit Rabbit Omni map DAB. Las secciones se incubaron con anticuerpos específicos dirigidos a EpCAM (n.º ab71916, abcam), caspasa-3 escindida (n.º 9661, Cell Signaling Technologies), netrina-1 (n.º CPA2389, Cohesion Biosciences), Unc5B (n.º 13851S, Cell Signaling Technologies) y CD8 (nº 4SM15, eBioscience). La tinción se realizó con peroxidasa de rábano picante anti-conejo, se visualizó con 3,3′-diaminobencidina como sustrato cromogénico y se contrateñió con hematoxilina de Gill. Las cuantificaciones histológicas se realizaron con el software Halo (Indica Labs).

La IHC cromogénica secuencial múltiple para vimentina/pancitoqueratina (panCK), como se describió anteriormente, se realizó en secciones de tumores de pacientes incluidos en el ensayo clínico NP137 y que se recolectaron en C1D1 y C3D1. Se sometieron secciones de tejido desparafinadas de 4 μm de espesor e incluidas en parafina a dos pasos sucesivos de IHC en una plataforma Ventana Discovery XT (Ventana, Roche Diagnostics) utilizando los sistemas de detección REDMap y DABMap de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. En un primer paso para la expresión de vimentina, los portaobjetos se incubaron con vimentina monoclonal de ratón anti-humana durante 1 h (ratón, clon V9, Leica, n.º NCL-L-VIM-V9, dilución 1:100) y se incubaron con anti-vimentina monoclonal de conejo. -anticuerpo secundario de ratón durante 20 min (clon M1gG51-4, abcam, nº 125913, dilución 1:750). Luego, los portaobjetos se incubaron con anticuerpo secundario anti-conejo biotinilado durante 24 minutos (Vector Laboratories, dilución 1:200) seguido de la adición del complejo estreptavidina-fosfatasa alcalina. La inmunotinción se detectó mediante incubación con naftol y rojo rápido. Las secciones de tejido se tiñeron con hematoxilina de Gill, se deshidrataron y se montaron. Se digitalizaron portaobjetos histológicos completos con un aumento de ×20 utilizando un escáner Hamamatsu 2.0 HT. Después de retirar los cubreobjetos, los portaobjetos se incubaron en etanol al 100% hasta la desaparición completa del color rojo. En un segundo paso, para mostrar la expresión de panCK, los portaobjetos se incubaron con anticuerpo monoclonal de ratón anti-panCK durante 1 h (ratón, clon CKAE1AE3, Dako Bélgica, nº M351529-2, dilución 1:150) y luego con anticuerpo monoclonal de conejo anti-panCK. -anticuerpo secundario de ratón durante 20 min. Luego, los portaobjetos se incubaron con anticuerpo secundario anti-conejo biotinilado durante 28 minutos (Vector Laboratories, dilución 1:200) seguido de la adición de estreptavidina-fosfatasa alcalina. La inmunotinción con PanCK se detectó mediante incubación con naftol y rojo rápido. Los portaobjetos de IHC se tiñeron con hematoxilina de Gill, se deshidrataron, se montaron y se digitalizaron nuevamente. El procesamiento y análisis de imágenes para el cálculo de la puntuación Hynrid EMT se realizaron utilizando Visiomorph DP 2018.4 para determinar la coexpresión de vimentina y panCK en cada portaobjetos de tejido. Brevemente, cada par de portaobjetos virtuales marcados con vimentina y panCK, que se adquirieron de la misma sección de tejido, se sometió a registro de imágenes. Las áreas positivas para vimentina y panCK se detectaron automáticamente en los portaobjetos virtuales alineados para evidenciar su coexpresión en las células tumorales. Esta coexpresión se evaluó en diapositivas completas con un aumento de ×10 para tener en cuenta posibles imperfecciones. Se llevaron a cabo correcciones manuales para excluir partes de la muestra irrelevantes, como la necrosis. También se excluyeron los núcleos celulares negativos para ambos marcadores, para centrarse únicamente en las áreas citoplasmáticas donde podría ocurrir la colocalización.

Se colocaron secciones de tejido FFPE en portaobjetos de Visium y se prepararon de acuerdo con los protocolos de 10x Genomics. Después de los pasos de tinción H&E, obtención de imágenes y desentrecruzamiento, las secciones de tejido se incubaron con sondas específicas para humanos dirigidas a 17,943 genes (10x Genomics, Visium Human Transcriptome Probe Set v.1.0). Las sondas hibridadas en ARNm se capturaron en portaobjetos de Visium y se preparó una biblioteca de expresión genética siguiendo el protocolo proporcionado y se secuenciaron en un Illumina NovaSeq 6000 con 50 000 lecturas por punto de profundidad de secuenciación específica.

Para cada sección FFPE, se procesaron archivos FASTQ e imágenes histológicas utilizando 10x Space Ranger v.2.0 para obtener la matriz de expresión genética asociada con cada punto.

Para realizar el análisis se utilizó Seurat v.4 (https://satijalab.org/seurat/) en R 4.1. Brevemente, se cargaron matrices filtradas, se fusionaron por paciente y se eliminaron los puntos con menos de 1.000 genes detectados. Después de la normalización de SCTransform, subclasificamos el punto tumoral de acuerdo con la identificación del punto patólogo y luego calculamos la puntuación de enriquecimiento del conjunto de genes EMT (paquete escape R) con el método UCell.

NP137 es el primer ensayo de fase I en humanos con una parte de aumento de dosis seguida de cohortes de extensión (NCT02977195) realizado en pacientes adultos con tumores sólidos avanzados o metastásicos. La parte de aumento de dosis se inició mediante una titulación de dosis acelerada con un paciente por nivel de dosis hasta la aparición de un evento adverso relacionado con el fármaco de grado 2 o superior. Después de la aparición de un evento adverso de grado 2 relacionado con NP137, los pacientes se inscribieron en un diseño de aumento de dosis más lento con al menos tres pacientes por nivel de dosis utilizando un método de reevaluación continua modificado. Se inscribieron pacientes adicionales en tres cohortes de biomarcadores, a niveles de dosis que habían sido declarados seguros, y se les sometió a biopsias pareadas con fines farmacodinámicos. En la parte de aumento de dosis, se inscribieron 19 pacientes en siete niveles de dosis (1 a 20 mg kg–1, intravenoso, cada dos semanas). No se observaron toxicidades limitantes de la dosis y 11 (58%) pacientes tuvieron reacciones relacionadas con la infusión de gravedad de grado 12, todos con dosis de 4 mg kg–1 y superiores14. Según los datos disponibles, se seleccionó 14 mg kg–1 cada 2 semanas como dosis recomendada para la Fase 2. Se abrieron dos cohortes de extensión, incluida una en pacientes con CE con receptores hormonales positivos (la inscripción se cerró en octubre de 2021).

El ensayo se llevó a cabo de acuerdo con las directrices de buenas prácticas clínicas, la Declaración de Helsinki y las leyes y directivas francesas y europeas pertinentes. Todos los pacientes procuraron su consentimiento escrito.

Los análisis estadísticos se realizaron en Prism (software GraphPad). En las leyendas de las figuras, n indica el número total de réplicas. Todas las pruebas estadísticas fueron bilaterales. Para los experimentos con ratones, no se utilizaron métodos estadísticos para predeterminar el tamaño de muestra necesario, pero el tamaño de la muestra se eligió basándose en experimentos piloto que aplicaron pruebas estadísticas apropiadas que podrían arrojar resultados significativos. Las curvas de supervivencia se analizaron mediante la prueba de rangos logarítmicos (Mantel-Cox). Las proporciones poblacionales se analizaron mediante pruebas de chi-cuadrado. La expresión de qPCR, la IHC de caspasa-3 y el peso de la tiroides se compararon mediante la prueba de Mann-Whitney. Para los datos que involucran a pacientes, las expresiones genéticas y las puntuaciones de EMT se compararon mediante la prueba t.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen del informe de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Los datos sin procesar de RNA-seq, RNA-seq unicelular y secuenciación transcriptómica espacial de este estudio se han depositado en Gene Expression Omnibus con el número de acceso. GSE225691. Para el control de versiones, el intercambio y la reproducibilidad, todo el código bioinformático relacionado con el análisis unicelular se conserva en un repositorio de GitHub (https://github.com/hernandezvargash/NP137_single.cell). Los datos originales se proporcionan con este documento.

Mehlen, P., Delloye-Bourgeois, C. y Chédotal, A. Funciones novedosas para hendiduras y netrinas: ¿señales de guía de los axones como objetivos anticancerígenos? Nat. Rev. Cáncer 11, 188–197 (2011).